麻痹性貝毒單克隆抗體的制備和酶聯(lián)免疫檢測方法的建立①

許道艷 劉 磊 劉仁沿 梁玉波 (國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連116023)

麻痹性貝毒(Paralttic shellfish poisoning，PSP)是由赤潮甲藻產(chǎn)生的一類含雙胍基的富氮三環(huán)生物堿化合物(圖1)，具有四氫嘌呤的基本結(jié)構(gòu)，PSP在全世界沿海都有分布，因赤潮生物種類及其地理分布不同，主要成分也不同，在溫帶海域最常見的毒素是膝溝藻毒素(Gonyautoxin2/3，GTX2/3)和石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)[1]，STX 一般占 PSP 毒素成分的85%以上，STX一直是PSP毒素成分的主要研究對象，因此本項(xiàng)目以STX為半抗原來制備檢測PSP的單克隆抗體。PSP在弱酸和低溫條件下比較穩(wěn)定[2]，通常的烹調(diào)方法不能改變其結(jié)構(gòu)及降低其毒性，主要污染濾食性貝類，污染的貝類被人類食用后，會產(chǎn)生四肢面部肌肉麻痹、頭痛惡心等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可窒息死亡。由于PSP分布廣泛、危害嚴(yán)重，引起各國的普遍重視，因此建立快速、靈敏、有效地毒素檢測方法顯得十分迫切。目前國際上普遍使用的貝毒監(jiān)測方法主要是生物小鼠法和高效液相色譜法(HPLC)[3-5]，但生物法存在誤差性大、重現(xiàn)性差，且存在不能分析樣品中具體組分的缺點(diǎn);而HPLC法能夠精確地測定毒素的種類和含量，但需要對樣品進(jìn)行繁瑣的前處理和購買昂貴的設(shè)備。因此，海洋生物樣品中麻痹性貝毒的監(jiān)測就受到了嚴(yán)重的限制。酶聯(lián)免疫吸附檢測方法(Enzyme-linked immolunosorbent assay，ELISA)克服了上述技術(shù)的局限性，為我們提供了一種快速、敏感而且操作簡單的分析方法，在小分子化合物的檢測中應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛[6，7]。本研究旨在制備可用于檢測海洋生物體內(nèi)的PSP的單克隆抗體，對于研發(fā)國產(chǎn)PSP檢測試劑盒具有重要的意義。

圖1 麻痹性貝類毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig．1 Structures of paralytic shellfish toxins

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 主要試劑和儀器 STX標(biāo)準(zhǔn)品(臺灣人宇公司);其他PSP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液均購自加拿大海洋生物科學(xué)研究所(NRC);血藍(lán)蛋白(KLH)，卵清白蛋白(OVA)，牛血清白蛋白(BSA)，二甲基亞砜(DMSO)，聚乙二醇(PEG)，HAT、HT 培養(yǎng)液均購自Sigma 公司;TMB 底物溶液(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、磷酸鹽-檸檬酸緩沖液、過氧化脲、EDTA-2Na、DMSO)為本實(shí)驗(yàn)室自行配制;RPMI1640和胎牛血清購于Gibco公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗鼠IgG(華美生物工程有限公司)。二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma SeriesⅡ)、倒置顯微鏡(Nikon100)，超凈工作臺(CA-1390-1)，高速冷凍離心機(jī)(Sigma 3K18)，微量移液器(Gilson)，快速高壓滅菌鍋(Tomy SS-325)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272)，酸度計(jì)(PHS-2C)，鼓風(fēng)干燥箱(GZX-9000)，酶標(biāo)儀(BIORAD Model 680)，洗板機(jī)(Thermo labsystems)。

1.2 方法

1.2.1 半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的制備 將0.5 mg石房蛤毒素 STX溶于250 μl PBS緩沖液(pH=6.5)中，加入75 μl 37%的甲醛，迅速加入500 μl血藍(lán)蛋白KLH(10 mg/ml)，25℃，振搖37小時(shí)，4℃過夜后，PBS緩沖液(pH=6.5)透析3天，用做免疫抗原。包被抗原STX-OVA偶聯(lián)方法同上。

1.2.2 BALB/c小鼠的免疫 以STX-KLH為免疫原，免疫5只6～8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用75 μl STX-KLH與等體積完全弗氏佐劑，充分乳化后，注射腹腔小鼠，第 3、5、7、9、11 周取同量STX-KLH與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化，腹腔注射。每次注射前由尾部取血測定小鼠血清的效價(jià)，待效價(jià)大于要求值后，融合的前3天，取100 μl STX-KLH的PBS溶液腹腔注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.2.3 ELISA測定血清或上清效價(jià) 用STX-OVA偶聯(lián)物作為包被抗原，用碳酸鹽緩沖液(pH=9.6)稀釋到適當(dāng)濃度添加到96孔酶標(biāo)板，每孔100 μl，4℃過夜;棄去殘液，洗滌三次、拍干，96孔酶標(biāo)板每孔加入300 μl封閉液，37℃孵育3小時(shí)，封閉好的96孔酶標(biāo)板可保存在4℃數(shù)周待用;測定時(shí)，棄去封閉液，洗板三次，拍干，加入適當(dāng)稀釋的血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔100 μl，37℃溫箱中孵育1小時(shí);從溫箱中取出酶標(biāo)板，洗板、拍干，加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)羊抗鼠第二抗體，每孔100 μl，37℃溫箱中孵育40分鐘;洗板、拍干，每孔加TMB底物溶液100 μl，37℃孵育10～20分鐘，以0.05 mol/L H2SO4每孔50 μl中止反應(yīng)，450 nm波長測定OD值。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞融合、篩選和克隆 取生長狀態(tài)良好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫好的小鼠脾細(xì)胞按照1∶5的比例進(jìn)行混合，加入促融劑PEG 0.7 ml進(jìn)行細(xì)胞融合，在20%胎牛血清的HAT培養(yǎng)基中選擇性培養(yǎng)，融合后的第3天換半液，4～6天有細(xì)胞克隆形成，取細(xì)胞培養(yǎng)液上清進(jìn)行ELISA檢測，選取陽性細(xì)胞孔，用有限稀釋法克隆，篩選可穩(wěn)定分泌抗PSP的單克隆抗體的細(xì)胞系，陽性孔需要經(jīng)過連續(xù)克隆3～4次，最后一次克隆后檢測陽性率為100%時(shí)，則所得細(xì)胞株即為分泌單克隆抗體的陽性細(xì)胞株。陽性細(xì)胞經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮長期保存。

1.2.5 腹水的制備 取6～8周齡雌性BALB/c小鼠6只，每只腹腔注射0.5 ml液體石蠟，1～2周后可用于注射雜交瘤細(xì)胞制備腹水。1 200r/min離心10分鐘收集陽性雜交瘤細(xì)胞，用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/ml，在液體石蠟處理過的小鼠腹腔內(nèi)注射0.5 ml陽性細(xì)胞懸液，注射7～10天后可見小鼠腹部明顯膨大，收集腹水，3 000 r/min，4℃，離心10 分鐘，收集上清液即為含單克隆抗體腹水，用間接ELISA方法測定腹水效價(jià)，-84℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 PSP系列物標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 PSP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液包括:①C毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液:C1(5.7 μmol/L)、C2(1.75 μmol/L);②膝溝藻毒素Gonyautoxins(GTXs)標(biāo)準(zhǔn)工作液:GTX1(2.65 μmol/L)、GTX2(2.95 μmol/L)、GTX3(0.975 μmol/L)、GTX4(0.875 μmol/L)、GTX5(1.625 μmol/L)、dcGTX2(2.85 μmol/L)、dcGTX3(0.8 μmol/L);③石房蛤毒素 Saxitoxins(STXs)標(biāo)準(zhǔn)工作液:neo-STX(6.5 μmol/L)、dcSTX(6.2 μmol/L)、STX(6.5 μmol/L)，將上述 PSP 用PBS稀釋成各濃度的使用液:15.625、31.25、62.5、125、250、375 和500 ng/ml共7 個(gè)梯度。

錢景汾表示，五礦商會將進(jìn)一步加強(qiáng)與上海市商務(wù)委、上海市化工行業(yè)協(xié)會的交流與合作，了解基地企業(yè)的實(shí)際需求，提供基地企業(yè)真正需要的服務(wù)，特別是在當(dāng)前復(fù)雜多變的經(jīng)濟(jì)形勢下，在貿(mào)易促進(jìn)、法律援助、信息咨詢培訓(xùn)、展覽會議、信用評級等方面扎實(shí)做好工作，提高基地企業(yè)的國際競爭力，共同推動中國化工出口基地（上海）建設(shè)邁上新的臺階。

1.2.7 間接競爭ELISA方法分析PSP各組分 96孔板的包被和封閉見1.2.3。測定時(shí)棄去封閉液，洗板3次，每孔加入50 μl稀釋的腹水和50 μl系列稀釋的各種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液或待測樣品溶液，振蕩混勻，37℃孵育1小時(shí)，其他步驟同血清或上清效價(jià)測定。以加入不同濃度的PSP系列標(biāo)準(zhǔn)物孔的吸光度值與空白對照孔的吸光度值比為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的PSP系列標(biāo)準(zhǔn)的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)物抑制率為50%時(shí)所需的濃度即IC50，交叉反應(yīng)率為STX的IC50與其它同系物IC50的比值。交叉反應(yīng)率=

1.2.8 高效液相色譜-熒光分析PSP 稱取一定量的貝類樣品勻漿，用0.1 mol/L的鹽酸溶液按照1∶1萃取，煮沸5分鐘，8 000 r/min離心20分鐘，取上清液，孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾，HPLC分析。HPLC條件為:GTX毒素流動相(主要針對 GTX1～GTX5、dcGTX2和dcGTX3):4.3 mmol庚烷磺酸鈉與10 mmol磷酸銨的混合液，磷酸調(diào) pH至7.1，0.45 μm過濾;STX毒素流動相(主要針對 STX、neoSTX和dcSTX):2 mmol庚烷磺酸鈉與30 mmol磷酸銨的混合液，磷酸調(diào)pH至7.1，0.45 μm過濾膜:乙腈(20∶1);流速:0.8 ml/min;進(jìn)樣量:5 μl;HPLC-FLD檢測器激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為330 nm和390 nm;氧化劑:7 mmol高碘酸與50 mmol磷酸鉀混合液，以磷酸調(diào)節(jié)pH至9.0;酸化劑:0.5 mol/L醋酸;流速:柱后氧化劑流速0.4 ml/min，酸化劑流速為0.4 ml/min;柱后反應(yīng)溫度:75℃。

1.2.9 生物小鼠法分析PSP 按照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)“貝類中麻痹性貝類毒素的測定”中規(guī)定的方法進(jìn)行(GB/T 5009.213-2008)。

2 結(jié)果

2.1 STX與載體蛋白的偶聯(lián)比 由于合成的STXKLH首次免疫過后，剩下的合成抗原在第二次免疫時(shí)，3只鼠均死亡，且臨死時(shí)均有典型的麻痹性貝毒上串抽搐而死的特征表現(xiàn)，計(jì)算出PSP含量為43.4 eqSTXμg/100g。據(jù)此得出 STX-KLH偶聯(lián)比為STX∶KLH=10∶1。為防止分解，每次免疫之前現(xiàn)合成免疫抗原，包被抗原也如此。

2.2 免疫小鼠的血清效價(jià) 以STX-KLH為免疫抗原，免疫8次后兩只BALB/c小鼠血清對STX-OVA的效價(jià)均在400左右。

2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞株

2.3.1 陽性雜交瘤細(xì)胞株的建立 免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0用PEG融合，每只鼠20塊96孔細(xì)胞板，HAT培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，當(dāng)每孔雜交瘤細(xì)胞覆蓋孔底30% ～50%時(shí)，ELISA方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體分泌情況，陽性率為4.5%。其中僅有8個(gè)陽性細(xì)胞孔有較明顯抑制作用，將上述8個(gè)陽性細(xì)胞孔進(jìn)行有限稀釋法克隆，最終獲得4株能穩(wěn)定分泌抗PSP特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為17#E8、17#D8、17#G6和17#F9。經(jīng)過連續(xù)傳代10代及凍存1個(gè)月后復(fù)蘇、ELISA效價(jià)檢測顯示該細(xì)胞株分泌抗體仍為強(qiáng)陽性，效價(jià)與原代細(xì)胞一致，證明這4株細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體的能力。

2.3.2 陽性細(xì)胞上清液和腹水的吸光度值 4株陽性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，細(xì)胞上清液的吸光度值見表1，結(jié)果表明該雜交瘤細(xì)胞株具有能分泌較高濃度的PSP抗體的能力。

通過小鼠腹腔注射陽性細(xì)胞株誘生腹水的方法，4株雜交瘤細(xì)胞株均能誘導(dǎo)出高效價(jià)的含抗PSP單克隆抗體的腹水，細(xì)胞株17#E8和17#F9誘生的腹水效價(jià)均在2×104以上(圖2)。

表1 不同細(xì)胞株上清的吸光度值(A)Tab．1 The absorbance value of different culture medium(A)

圖2 兩株不同稀釋倍數(shù)腹水的吸光度值(A)Fig．2 The absorbance value of two ascites serially diluted(A)

圖3 PSP抗體對STX組分結(jié)合率反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．3 Standard curve of STX to PSP antibody

2.4 間接競爭ELISA方法分析PSP各種組分

2.4.1 最適反應(yīng)條件的確定 用點(diǎn)陣法確定了競爭ELISA方法的包被抗原STX-OVA最佳稀釋度為1∶500;腹水的稀釋倍數(shù)為1∶1 000;HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗的濃度為1∶1 000;底物顯色液的時(shí)間為18分鐘。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以抗原STX標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率為縱坐標(biāo)，繪制結(jié)合率反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 3)。線性回歸方程為 y=-0.169 6x+1.490 1，R2=0.9785。求出抑制率為50%時(shí)所需的STX標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度(IC50)為220 ng/ml，對STX組分的檢出限為20 ng/ml。

圖4 PSP抗體對其余各種組分的結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．4 Standard curve of other components to PSP antibody

用間接競爭ELISA方法檢測PSP系列其余標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的抑制反應(yīng)(圖4)，從中可以看出該抗體對其余PSP組分幾乎沒有抑制，僅對GTX2/3有明顯的抑制效果，IC50為 50 ng/ml，檢出限為 10 ng/ml。由上述結(jié)果可知，該抗體對GTX2/3的交叉反應(yīng)率為440%，其他組分交叉反應(yīng)率均低于1%。表明所制備的單克隆抗體對PSP中的STX組分和GTX2/3組分具有高特異性。

2.5 HPLC方法、生物小鼠法與ELISA方法的比較分別用HPLC方法、生物小鼠法與ELISA方法分析78個(gè)貝類生物樣品，用SPSS11.0軟件分別進(jìn)行成對t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示:HPLC方法與ELISA方法在針對 GTX2/3組分的檢測時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.908 2、在針對 PSP的檢測時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.864 7;用生物小鼠法與ELISA方法在分析貝類體內(nèi)PSP含量時(shí)，相關(guān)系數(shù)為0.861 1。

3 討論

近些年來，免疫檢測技術(shù)在抗生素、農(nóng)藥和毒素等小分子化合物殘留分析中的應(yīng)用越來越廣泛，而抗體的制備則是建立免疫檢測技術(shù)的關(guān)鍵。由于PSP各組分的分子量均在300 Da左右，沒有免疫原性，合成高質(zhì)量的人工抗原較困難[3-8];STX標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴，來源渠道極少，限制了關(guān)于建立PSP的ELISA分析方法的研究。抗原合成的原則是半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)位置最好遠(yuǎn)離重要的抗原決定簇，從而使遠(yuǎn)離聯(lián)結(jié)位點(diǎn)的半抗原部分具有較好的識別能力，進(jìn)而獲得效價(jià)高、特異性好的抗體，本實(shí)驗(yàn)以甲醛通過縮水反應(yīng)分別將蛋白質(zhì)KLH、OVA的氨基與STX的胍基連接起來，成功合成了具有免疫原性的免疫抗原和包被抗原。通過動物免疫、細(xì)胞融合、篩選、克隆和腹水制備，最終獲得了4株高效價(jià)的抗STX和GTX2/3特異性單克隆抗體。間接競爭ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對STX組分的IC50為220 ng/ml，對 GTX2/3 的 IC50為50 ng/ml，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國際上赤潮毒素警戒濃度規(guī)定的80 μg/100 g(按本研究建立的方法相當(dāng)于800 ng/ml)靈敏度要求。該抗體對 PSP 其他組分(Neo-b、GTX1/4、GTX5、C1/2、dc-STX、dc-GTX2/3)交叉反應(yīng)率低。本研究所制備抗體具有高特異性和靈敏性，可用于研制高質(zhì)量的國產(chǎn)快速檢測PSP的ELISA試劑盒。

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