• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    骨髓增生異常綜合征患者外周血Th22細胞水平的變化及意義

    2013-11-27 11:15:38韓雪花劉立民張彥明張興霞趙廣圣司葉俊林國強何廣勝吳德沛
    中國免疫學雜志 2013年1期
    關鍵詞:危組外周血引物

    韓雪花 劉立民 張彥明 張興霞 趙廣圣 司葉俊 林國強 何廣勝 吳德沛

    (徐州醫(yī)學院附屬淮安醫(yī)院 淮安市第二人民醫(yī)院中心實驗室,淮安223002)

    骨髓增生異常綜合征(MDS)是血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病,具有向急性髓系白血病(AML)轉化的高風險。研究已經(jīng)證實,MDS患者固有免疫細胞和適應性免疫細胞存在質或量的異常,如B細胞、T細胞、NK 細胞、單核巨噬細胞[1,2]。Th22 型細胞是一種最新發(fā)現(xiàn)的獨立的輔助性T細胞亞群,是體內分泌IL-22的主要細胞,具有促進機體固有免疫和適應性免疫應答,使腫瘤細胞的周期停滯在G2/M期,降低細胞增殖率的作用[3,4]。在樹突狀細胞(DC)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)刺激的條件下,IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22型細胞的分化。TGF-β顯著抑制Th22細胞的分化和IL-22產(chǎn)生[5,6]。我們前期的研究已經(jīng)證實急性髓細胞白血病患者外周血Th22細胞較正常人減少[7],對于MDS患者體內Th22細胞變化情況目前尚無文獻報道,我們通過檢測Th22細胞比例、IL-22和IL-22相關轉錄因子的表達水平在MDS組及正常對照組外周血中的變化,并初步探討其意義,為進一步研究Th22細胞在MDS免疫機制及發(fā)病機制中的作用提供資料。

    1 材料與方法

    1.1 研究對象 選擇2009年9月至2012年3月在我院血液科住院的MDS患者共27例,均按文獻[8]確診,其中男16例,女11例,平均年齡51(18~83)歲。根據(jù)WHO的MDS診斷標準進行分類,其中難治性貧血(RA)6例,難治性貧血伴環(huán)形鐵粒幼細胞增多(RARS)5例,難治性血細胞減少伴多系增生異常(RCMD)4例,難治性貧血伴原始細胞增多(RAEB-Ⅰ、RAEB-Ⅱ)12例。根據(jù)IPSS積分系統(tǒng)進行危險度分級低危(0分)6例,中危-Ⅰ(0.5~1.0分)7例,中危-Ⅱ(1.5~2.0分)8例,高危(≥2.5分)6例。在此基礎上再分為兩組:較低危組(IPSS積分0~1.0分)13例,較高危組(IPSS積分≥1.5分)14例。對照組20名,平均年齡50(25~78)歲,均為健康體檢者,無腫瘤及自身免疫疾病史。各組間年齡、性別無差異,所有觀察對象均于清晨空腹抽取靜脈血3~4 ml,肝素抗凝。

    1.2 主要試劑 完全培養(yǎng)基:RPMI1640為Hyclone公司產(chǎn)品,淋巴細胞分離液、胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品,CD4-FITC、IL-22-PE單克隆抗體為 BD 公司產(chǎn)品,IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒為上海森雄科技實業(yè)有限公司產(chǎn)品,RNA提取試劑Tripure reagent為Roche公司產(chǎn)品,M-Mulv Reverse Transcriptase購自 Promega公司,IL-22 mRNA引物設計、合成均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 細胞及血清樣本準備 抽取各組研究對象外周血3 ml室溫靜置30分鐘,以1 500 r/min離心15分鐘取其上層血清,于-20℃保存?zhèn)溆?,剩余樣本加PBS液稀釋1倍混勻后加入分離液Ficoll-Hypaque,以1 500 r/min離心10分鐘,收集單個核細胞層于離心管中,以RPMI1640培養(yǎng)液重懸細胞并計數(shù),調整細胞密度為2×106細胞/ml,將所得單個核細胞接種于24孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時,采用流式細胞術和RT-PCR分別檢測各組Th22細胞比例、IL-22 mRNA的表達水平。

    1.3.2 Th22細胞測定 取各組標本單個核細胞用FACS緩沖液(含2%FCS和0.1%疊氮鈉的PBS)洗2遍,于4℃下用10%的羊血清封閉細胞表面抗體15分鐘,調整細胞濃度2×106ml-1,取100 μl加入CD4-FITC、IL-22-PE 單克隆抗體各 20 μl,另設同型陰性對照,于4℃下溫育30分鐘后置于流式細胞儀進行檢測。用Th22細胞占外周血CD4+T細胞的比例來評價Th22細胞的水平。

    1.3.3 細胞因子測定 用ELISA法測定各組IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 水平,具體實驗步驟按ELISA檢測試劑盒說明書進行。顯色后即刻用酶標儀檢測450 nm波長的光密度D值,根據(jù)標準曲線確定 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 的含量,最小可測值為3.96 pg/ml。

    1.3.4 IL-22 mRNA的表達水平檢測 ①取各組標本單個核細胞,調整細胞密度為2×106ml-1,采用TRIzol一步法提取總RNA,操作按說明書進行。紫外分光光度計測定RNA的A260/A260值以確定RNA的純度和總量。②分別取各組 10 μg(5 μl)總RNA,進行逆轉錄,逆轉錄反應體系為40 μl,擴增條件為94℃預變性3分鐘;94℃ 30秒,53℃ 30秒,72℃ 40秒;28個循環(huán)。72℃延伸8分鐘。擴增產(chǎn)物為560 bp。以β-actin為內參。③引物設計合成如下:人IL-22 mRNA上游引物5'-CATAGTGAAGGCAGGAATCACA-3',下游引物:5'-TAGTCCGAAATGAGGCTGTCTT-3'。β-actin上游引物:5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3',下游引物:5'-AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'。④電泳分析:每個樣品取8 μl擴增產(chǎn)物,行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像系統(tǒng)攝取各樣品電泳圖,并通過成像分析軟件Quantity One進行半定量分析。計算樣品中目的基因與β-actin擴增條帶的A值比值,數(shù)據(jù)用±s標準差表示。

    1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS11.5軟件作數(shù)據(jù)處理,測量指標以±s描述,多組間均數(shù)比較采用方差分析。

    2 結果

    圖1 流式細胞術檢測MDS患者和正常對照組外周血中Th22細胞所占比例Fig.1 The proportion of Th22 cells in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors was evaluated by flow cytometry

    表1 MDS患者和正常對照組外周血中 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平(ng/L,±s)Tab.1 IL-22,TGF-β,TNF-α and IL-6 production in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors(ng/L,±s)

    表1 MDS患者和正常對照組外周血中 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平(ng/L,±s)Tab.1 IL-22,TGF-β,TNF-α and IL-6 production in the peripheral blood of MDS patients and healthy donors(ng/L,±s)

    Note:1)P<0.05 vs control;2)P<0.05 vs high-grade group.

    IL-6 High-grade 14 13.51±3.871) 5.21±1.651) 146.74±29.741) 77.58±16.231)Groups n IL-22 TGF-β TNF-α 0.41 137.95±27.08 Low-grade 13 16.13±4.821)2) 7.46±2.17 1)2) 182.34±37.551)2) 95.62±20.281)2)Control 20 19.72±6.55 9.65±2.78 238.32±5

    2.1 外周血Th22細胞水平 流式細胞術檢測結果示MDS較高危組和較低危組Th22細胞占外周血CD4+T細胞比例分別為(0.53±0.13)%和(0.85±0.21)%,明顯低于正常對照組的(1.24±0.31)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。較低危組Th22細胞占外周血CD4+T細胞的比例高于較高危組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖1)。

    2.2 外周血 IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6 的表達水平MDS較高危組和較低危組外周血IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平明顯低于正常對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且較低危組外周血IL-22、TGF-β、TNF-α、IL-6水平高于較高危組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05,表1)。

    2.3 外周血單個核細胞中Th22細胞的相關轉錄因子IL-22 mRNA的表達水平 MDS較高危組和較低危組外周血單個核細胞中Th22細胞IL-22 mRNA的表達水平分別為0.29±0.06和0.38±0.07,明顯低于正常對照組0.49±0.09,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而較低危組外周血中IL-22 mRNA的表達水平高于較高危組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,圖2)。

    3 討論

    圖2 RT-PCR檢測MDS患者和正常對照組外周血IL-22 mRNA表達Fig.2 IL-22 mRNA of MDS patients and healthy donors was examined by RT-PCR

    Th22細胞是近些年來發(fā)現(xiàn)的一群不同于已知的Th1細胞、Th2細胞及Th17細胞的新型CD4+Th細胞亞群,具有分泌IL-22的能力,故稱之為“Th22”細胞[9],進一步研究證實Th22細胞為CD3+CD4+亞群,CD8、NK細胞表面標志物CD56及Foxp3均為陰性,是一類新的、獨立的T細胞亞群[3]。在DC、pDC刺激下,IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22型細胞的分化[9],而轉化生長因子(TGF)-β 顯著抑制 Th22 的分化[5,6]。Th22 細胞的關鍵轉錄因子是芳香烴受體,主要分泌IL-22,還可分泌 IL-10、IL-13、IL-26、腫瘤壞死因子(TNF)-α 等細胞因子,其功能主要是通過IL-22來實現(xiàn)的。研究證實,IL-22通過調節(jié)上皮細胞的生物學活性,在抗感染,誘導急性炎性介質反應,增強宿主防御和上皮屏障功能,參與組織損傷修復等方面發(fā)揮著重要作用[10,11]。Th22細胞可誘導補體經(jīng)典激活途徑和旁路途徑中的因子活化,啟動補體的應答通路。IL-22可以增強TNF-α的信號轉導,加大其促炎作用,這些研究結果均說明Th22細胞有可能具有促進機體固有免疫和適應性免疫應答的作用。此外,IL-22具有更重要的功能是參與細胞增生、分化以及凋亡的調節(jié)。在腫瘤細胞的研究中發(fā)現(xiàn),IL-22可調節(jié)腫瘤細胞周期,使其停留在G2/M期,降低細胞的增殖率[4]。至于MDS患者體內Th22細胞究竟會發(fā)生何種變化此前尚無報道。

    在本項研究中我們通過ELISA、流式細胞術及RT-PCR等檢測發(fā)現(xiàn) MDS較高危組和較低危組Th22細胞及其效應因子、相關轉錄因子的表達水平明顯低于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學意義。同時,我們也發(fā)現(xiàn)MDS較低危組Th22細胞比例及其效應因子、相關轉錄因子的表達水平高于較高危組,差異具有統(tǒng)計學意義。這提示MDS患者體內Th22細胞數(shù)量減少,隨著疾病危險度的升高表現(xiàn)更加明顯。說明Th22細胞有可能和MDS的發(fā)生發(fā)展緊密相關。MDS患者免疫功能低下除和 DC、pDC、Th17、Treg、NK等細胞相關外可能和Th22細胞數(shù)量減少也有一定關系。

    ELISA檢測結果顯示MDS患者外周血中TNF-α、IL-6、TGF-β的水平低于正常人,差異有統(tǒng)計學意義。較高危組TNF-α、IL-6、TGF-β的水平低于較低危組,差異有統(tǒng)計學意義。已經(jīng)證實在DC、pDC刺激下,IL-6和TNF-α可以促進人CD4+初始T細胞向Th22細胞的分化,而轉化生長因子TGF-β顯著抑制Th22的分化。因此,我們推測可能是在MDS患者體內因為DC、pDC數(shù)量減少、功能減低,使其對CD4+初始T細胞的刺激作用減弱,IL-6和TNF-α水平減低使其對CD4+初始T細胞向Th22細胞分化的促進作用減弱,導致了MDS患者體內Th22細胞數(shù)量減少。值得一提的是AML患者外周血Th22細胞水平低于正常,而TGF-β的水平高于正常[7],但在MDS患者外周血Th22細胞及TGF-β水平均低于正常。這提示盡管MDS和AML均屬血液系統(tǒng)的惡性克隆性疾病,且MDS具有向AML轉化的高風險,但MDS同AML相比尚具有自身的特點。對于產(chǎn)生這一結果的原因目前尚不清楚,有待于作進一步深入研究。Treg細胞在MDS患者外周血中的比例較正常對照組明顯增高[12],所以,在MDS患者體內可能存在Treg等負向免疫調節(jié)細胞同Th22細胞分化相互拮抗。有關Th22細胞在MDS免疫機制及發(fā)病機制中的作用有待于作進一步的深入研究。

    1 王化泉,邵宗鴻.免疫妥協(xié)與骨髓增生異常綜合征克隆[J].中華血液學雜志,2005;26(1):60-62.

    2 Hamblin T J.Immunology aspects of the myelodysplastie syndmme//Bennett JM.The myelodysplastie syndrome:pathobiology and clinical management[M].New York:Marcel Dekker,2002:65-88.

    3 Stefanie E,Kilian E,Davide P.Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling[J].J Clin Invest,2009;119(12):3573-3585.

    4 Weber G F,Gaertner F C,Erl W et al.IL-22-mediated tumor growth reduction correlates with inhibition of ERK1/2 and AKT phosphorylation and induction of cell cycle arrest in the G2-M phase[J].J Immunol,2006(11);177:8266-8272.

    5 Zheng Y,Danflenko D M,Valdez P et al.Interleukin-22,a Th17 cytokine,mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosia[J].Nature,2007;445(7128):648-651.

    6 Duhen T,Geiger R,Jarrossay D et al.Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a subset of human skin-homing memory T cells[J].Nat Immunol,2009;10(8):857-872.

    7 劉立民,張興霞,張彥明 et al.急性髓系白血病患者外周血Th22細胞水平的變化[J].中華血液學雜志,2012;33(2):133-135.

    8 張之南,沈 悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京:科學出版社,2007:184-186.

    9 Trifari S,Kaplan C D,Tran E H et al.Identification of a human helper T cell population that has abundant production of interleukin 22 and is distinct from Th17,Th1 and Th2 cells[J].Nat Immunol,2009,10(8):864-871.

    10 Sa S M,Valdez P A,Wu J et al.The effects of IL-20 subfamily cytokines on reconstituted human epidermis suggest potential roles in cutaneous innate defeose and pathogenic adaptive immunity in psoriasis[J].J Immunol,2007;178(4):2229-2240.

    11 Wolk K,Witte E,Wallace E et al.IL-22 regulates the expression of genes responsible for antimicrobial defense,cellular differentiation and mobility in keratinoeytes:a potential role in psoriasis[J].Eur J Immunol,2006;36(5):1309-1323.

    12 王化泉,邵宗鴻,邢莉民et al.骨髓增生異常綜合征患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性T細胞和Th3細胞變化[J].中華血液學雜志,2008;29(7):482-484.

    猜你喜歡
    危組外周血引物
    DNA引物合成起始的分子基礎
    高中生物學PCR技術中“引物”相關問題歸類分析
    生物學通報(2022年1期)2022-11-22 08:12:18
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    超聲心動圖用于非瓣膜病性心房顫動患者卒中危險分層
    ING4在結腸和直腸的胃腸間質瘤表達的研究
    火炬松SSR-PCR反應體系的建立及引物篩選
    白血病外周血體外診斷技術及產(chǎn)品
    結腸炎小鼠外周血和結腸上皮組織中Gal-9的表達
    慢性蕁麻疹患者外周血IL-17和IL-23的表達及臨床意義
    心肌梗死溶栓試驗危險評分對急性心肌梗死患者預后的評估價值
    乱人伦中国视频| 天堂影院成人在线观看| 日韩高清综合在线| 精品人妻1区二区| 丁香欧美五月| 免费av毛片视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 午夜a级毛片| 亚洲第一av免费看| 精品久久久久久,| 日本 av在线| 国产免费现黄频在线看| 老鸭窝网址在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 黄频高清免费视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜福利免费观看在线| 国产伦人伦偷精品视频| 青草久久国产| 男人操女人黄网站| 性欧美人与动物交配| 成人手机av| 久久人妻熟女aⅴ| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲av电影在线进入| 国产一区二区三区综合在线观看| 成在线人永久免费视频| 国产有黄有色有爽视频| 国产成人精品久久二区二区91| 在线看a的网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 男女之事视频高清在线观看| 视频在线观看一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| xxx96com| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 午夜免费激情av| svipshipincom国产片| 不卡av一区二区三区| 国产精品影院久久| 日韩欧美免费精品| 欧美中文日本在线观看视频| 岛国在线观看网站| 国产欧美日韩一区二区三| cao死你这个sao货| 两个人看的免费小视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美黑人精品巨大| 99riav亚洲国产免费| svipshipincom国产片| 国产精品一区二区精品视频观看| 另类亚洲欧美激情| tocl精华| 高清在线国产一区| 久久 成人 亚洲| 一级毛片高清免费大全| 一级毛片女人18水好多| 一级毛片高清免费大全| 亚洲午夜理论影院| 九色亚洲精品在线播放| 在线观看www视频免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 久久久久亚洲av毛片大全| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲片人在线观看| 又大又爽又粗| 黑人欧美特级aaaaaa片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲九九香蕉| www.精华液| 欧美日韩av久久| 精品一品国产午夜福利视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 18禁观看日本| 日韩欧美免费精品| 美女扒开内裤让男人捅视频| 一级黄色大片毛片| www.999成人在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频 | 一个人观看的视频www高清免费观看 | 精品久久蜜臀av无| 亚洲熟女毛片儿| 91精品三级在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美色视频一区免费| 女警被强在线播放| 精品国产一区二区久久| svipshipincom国产片| 中文字幕av电影在线播放| 又黄又爽又免费观看的视频| 男人舔女人的私密视频| 亚洲激情在线av| 久久久国产精品麻豆| 国产精品久久视频播放| 精品久久蜜臀av无| 咕卡用的链子| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲激情在线av| tocl精华| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一级,二级,三级黄色视频| 搡老乐熟女国产| 激情视频va一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美中文日本在线观看视频| 欧美日韩av久久| a级片在线免费高清观看视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 黄色怎么调成土黄色| www.自偷自拍.com| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 天堂俺去俺来也www色官网| 日本精品一区二区三区蜜桃| 操出白浆在线播放| 老司机亚洲免费影院| 一区福利在线观看| 男人操女人黄网站| 热99国产精品久久久久久7| 在线观看免费视频网站a站| 男人的好看免费观看在线视频 | 天天添夜夜摸| 夫妻午夜视频| 91字幕亚洲| 极品教师在线免费播放| av天堂久久9| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩欧美三级三区| 亚洲av第一区精品v没综合| e午夜精品久久久久久久| 99国产精品一区二区三区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 9191精品国产免费久久| 另类亚洲欧美激情| 操美女的视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 美女高潮到喷水免费观看| 又大又爽又粗| 99久久国产精品久久久| 看免费av毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 一区二区三区精品91| 国产精品野战在线观看 | 亚洲男人的天堂狠狠| 一区二区三区激情视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲人成电影观看| 精品久久久精品久久久| 天堂动漫精品| 欧美中文日本在线观看视频| 国产成人欧美| 久久人妻福利社区极品人妻图片| xxx96com| 日韩成人在线观看一区二区三区| 91国产中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | 日本黄色日本黄色录像| 国产精品久久电影中文字幕| 自线自在国产av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产高清videossex| 欧美日韩亚洲高清精品| 精品福利永久在线观看| 丝袜美足系列| 亚洲av美国av| 人妻久久中文字幕网| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产成人欧美在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 国产精品av久久久久免费| 国产成人啪精品午夜网站| 超碰97精品在线观看| 亚洲九九香蕉| 国产激情欧美一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 69精品国产乱码久久久| 一级a爱视频在线免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人精品久久二区二区91| 久久久久精品国产欧美久久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美成人免费av一区二区三区| 一本大道久久a久久精品| 午夜两性在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 黄片大片在线免费观看| 久久香蕉激情| 成熟少妇高潮喷水视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲全国av大片| 国产成年人精品一区二区 | 看片在线看免费视频| 国产成人欧美| 五月开心婷婷网| 99久久国产精品久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 男人的好看免费观看在线视频 | 成人av一区二区三区在线看| 午夜亚洲福利在线播放| 在线观看免费高清a一片| 一a级毛片在线观看| 99热国产这里只有精品6| 欧美激情久久久久久爽电影 | av福利片在线| 欧美成人午夜精品| 黄色视频,在线免费观看| 国产人伦9x9x在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜精品久久久久久毛片777| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 精品国产乱子伦一区二区三区| 免费少妇av软件| 真人一进一出gif抽搐免费| 超碰成人久久| 十八禁网站免费在线| 校园春色视频在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲色图av天堂| 久久精品人人爽人人爽视色| 脱女人内裤的视频| 免费少妇av软件| 日本一区二区免费在线视频| 老汉色∧v一级毛片| 大型av网站在线播放| 久久久久久久久中文| 欧美激情 高清一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久久久久人人人人人| 欧美成狂野欧美在线观看| 99国产精品一区二区三区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产成人系列免费观看| e午夜精品久久久久久久| 老司机靠b影院| cao死你这个sao货| 精品久久久精品久久久| 一个人免费在线观看的高清视频| 一级毛片女人18水好多| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| √禁漫天堂资源中文www| 午夜免费成人在线视频| 久久九九热精品免费| 老司机亚洲免费影院| 成人亚洲精品一区在线观看| 一级毛片女人18水好多| 亚洲av美国av| 最近最新中文字幕大全电影3 | 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 嫩草影院精品99| 一级毛片女人18水好多| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费看a级黄色片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲专区国产一区二区| 久久亚洲真实| 无限看片的www在线观看| av有码第一页| 国产精品野战在线观看 | 韩国av一区二区三区四区| 亚洲男人天堂网一区| 成人亚洲精品av一区二区 | 日本三级黄在线观看| av中文乱码字幕在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 日本a在线网址| netflix在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区久久 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 国产高清videossex| 搡老岳熟女国产| 视频区图区小说| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产av又大| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲av熟女| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲久久久国产精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜福利欧美成人| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 成人国产一区最新在线观看| 热99re8久久精品国产| 激情视频va一区二区三区| 亚洲精华国产精华精| www日本在线高清视频| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 日韩有码中文字幕| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久久国内视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲精华国产精华精| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 满18在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 满18在线观看网站| 激情在线观看视频在线高清| 母亲3免费完整高清在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 丝袜美腿诱惑在线| 香蕉久久夜色| 日本免费a在线| 精品高清国产在线一区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲久久久国产精品| 精品第一国产精品| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲,欧美精品.| svipshipincom国产片| 在线观看一区二区三区| av网站在线播放免费| 在线观看一区二区三区激情| 精品日产1卡2卡| 亚洲自拍偷在线| 精品一区二区三区四区五区乱码| 韩国精品一区二区三区| 很黄的视频免费| 97碰自拍视频| 免费在线观看黄色视频的| 国产99白浆流出| 国产色视频综合| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 成人特级黄色片久久久久久久| www.www免费av| 一级黄色大片毛片| 国产精华一区二区三区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久午夜亚洲精品久久| 久久久久久人人人人人| 日本wwww免费看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 性少妇av在线| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲免费av在线视频| 色在线成人网| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费少妇av软件| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产又爽黄色视频| 日本三级黄在线观看| 亚洲第一av免费看| 成年人黄色毛片网站| 久久青草综合色| 麻豆成人av在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日本一区二区免费在线视频| 热re99久久精品国产66热6| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 窝窝影院91人妻| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 国产精品 国内视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 波多野结衣av一区二区av| 久久久久久久午夜电影 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产伦人伦偷精品视频| 脱女人内裤的视频| 日本 av在线| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 91成年电影在线观看| 夫妻午夜视频| 国产野战对白在线观看| 后天国语完整版免费观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 日本三级黄在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 99riav亚洲国产免费| 高清欧美精品videossex| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲美女黄片视频| bbb黄色大片| 九色亚洲精品在线播放| 高清毛片免费观看视频网站 | cao死你这个sao货| 国产精品亚洲一级av第二区| 两性夫妻黄色片| 麻豆久久精品国产亚洲av | 美女大奶头视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 多毛熟女@视频| 国产欧美日韩一区二区三| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产亚洲精品一区二区www| 黄频高清免费视频| 水蜜桃什么品种好| 午夜精品在线福利| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久国产成人精品二区 | 精品国内亚洲2022精品成人| 黑丝袜美女国产一区| 一本综合久久免费| a级毛片在线看网站| 亚洲欧美激情在线| bbb黄色大片| 午夜影院日韩av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 午夜a级毛片| 欧美大码av| 日本黄色日本黄色录像| 搡老熟女国产l中国老女人| 香蕉丝袜av| 热99国产精品久久久久久7| a级毛片在线看网站| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久99久视频精品免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 中文字幕色久视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 香蕉丝袜av| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产男靠女视频免费网站| 91麻豆av在线| 亚洲第一青青草原| 看黄色毛片网站| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精华一区二区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一区二区日韩欧美中文字幕| 91老司机精品| 极品教师在线免费播放| 九色亚洲精品在线播放| 黄片播放在线免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久国产亚洲av麻豆专区| 免费观看人在逋| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| www.www免费av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 中文字幕色久视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 丝袜美足系列| 久久亚洲真实| 久久久久久人人人人人| 精品久久蜜臀av无| 亚洲,欧美精品.| 美女福利国产在线| 69av精品久久久久久| 亚洲精品在线美女| 亚洲人成伊人成综合网2020| 美女午夜性视频免费| 黄色丝袜av网址大全| 国产黄a三级三级三级人| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩人妻精品一区2区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av | 免费av毛片视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 黄色视频,在线免费观看| 欧美精品亚洲一区二区| 99香蕉大伊视频| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 中亚洲国语对白在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 宅男免费午夜| 午夜日韩欧美国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久人人97超碰香蕉20202| 中文字幕色久视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 黑人操中国人逼视频| 日韩av在线大香蕉| 色哟哟哟哟哟哟| 午夜激情av网站| 麻豆国产av国片精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 老鸭窝网址在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美日韩一级在线毛片| 韩国精品一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久中文看片网| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品久久久久久久毛片微露脸| 免费日韩欧美在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色哟哟哟哟哟哟| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 伦理电影免费视频| 亚洲中文av在线| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产区一区二久久| 日本 av在线| 脱女人内裤的视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 在线视频色国产色| 免费av中文字幕在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲国产欧美网| 亚洲性夜色夜夜综合| 热99国产精品久久久久久7| 日韩高清综合在线| 成人国产一区最新在线观看| 人妻久久中文字幕网| 亚洲,欧美精品.| 中文字幕高清在线视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品亚洲一级av第二区| 女警被强在线播放| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 搡老乐熟女国产| 成人免费观看视频高清| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产不卡一卡二| 国产成人av激情在线播放| 亚洲性夜色夜夜综合| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美一级毛片孕妇| 免费在线观看完整版高清| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产99白浆流出| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲片人在线观看| 久久青草综合色| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 日韩大尺度精品在线看网址 | 天堂动漫精品| 久久久久久久久免费视频了| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲视频免费观看视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 国产一区二区在线av高清观看| 美女福利国产在线| av有码第一页| xxxhd国产人妻xxx| 日本精品一区二区三区蜜桃| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲中文字幕日韩| 精品国产一区二区久久| 精品人妻在线不人妻| 欧美最黄视频在线播放免费 | 免费av中文字幕在线| 美女高潮到喷水免费观看| 国产精品国产高清国产av| 午夜精品在线福利| 成人三级黄色视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久99一区二区三区| www.自偷自拍.com| xxx96com| 欧美在线一区亚洲| 自线自在国产av| 精品第一国产精品| 69av精品久久久久久| 99久久人妻综合| 久久久久久久久免费视频了| cao死你这个sao货| 日本五十路高清| 黄色怎么调成土黄色| 母亲3免费完整高清在线观看| av天堂在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 999久久久精品免费观看国产| 精品久久蜜臀av无| 国产免费现黄频在线看| 在线观看www视频免费| 精品久久久久久成人av| 极品教师在线免费播放| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜成年电影在线免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本免费a在线| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄片播放在线免费| 亚洲五月天丁香|