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    丹皮酚抑制小鼠乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)作用及機(jī)制的研究①

    2013-11-27 11:15:34王建杰閆冬梅宋漢君歐葉濤佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院佳木斯154007
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:丹皮乳腺癌誘導(dǎo)

    王建杰 閆冬梅 董 航 宋漢君 歐葉濤 商 宇 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,佳木斯154007)

    90年代在中藥治療宮頸癌、肝癌、肺癌、喉癌、乳腺癌等有效方劑中均含有牡丹皮,為此人們開(kāi)始研究牡丹皮的抗腫瘤作用[1,2]。丹皮酚 (Paeonol)是牡丹皮中的活性成分。據(jù)報(bào)道,丹皮酚對(duì)多種腫瘤細(xì)胞,如人紅白血病細(xì)胞K562、人宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌細(xì)胞BEL-7404以及大腸癌HT-29細(xì)胞的增殖等具有抑制作用,并且報(bào)道其抗腫瘤機(jī)制為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或提高免疫分子的活性,包括減少Bcl-2與Bax的比值,上調(diào) Fas/FasL蛋白的表達(dá)和Caspase-3 的表達(dá),調(diào)節(jié)PTEN/Akt信號(hào)通路[3-5]。我們先前的研究表明,丹皮酚能減少乳腺癌小鼠腫瘤組織中p53、Bcl-2以及CerbB-2的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),從而提示丹皮酚可能通過(guò)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[6]。本研究通過(guò)觀察丹皮酚對(duì)EMT6乳腺癌小鼠腫瘤組織形態(tài)、凋亡指數(shù)以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá),進(jìn)一步闡明丹皮酚抗乳腺癌的作用及其機(jī)制,為傳統(tǒng)中藥治療乳腺癌提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑藥品 丹皮酚來(lái)自沈陽(yáng)藥科大學(xué)提純分離,純度 >98%。環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)為江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)原位凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物技術(shù)有限公司。兔抗鼠Bcl-2、Bax單克隆抗體購(gòu)自福建邁新生物有限公司。Trizol試劑購(gòu)于Gibco公司,反轉(zhuǎn)錄 cDNA合成試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa生物公司,β-actin多克隆抗體來(lái)自北京博奧森生物有限公司。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株 雌性昆明種小鼠,體重18~22克,購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。自由飲水,清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)房,溫、濕度適宜,光照8~10小時(shí)/天。小鼠乳腺癌EMT6細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。

    1.2 方法

    1.2.1 動(dòng)物模型建立及藥物處理 以生理鹽水調(diào)節(jié)小鼠乳腺癌細(xì)胞株EMT6濃度至107個(gè)/ml,于小鼠右前肢腋下注射0.2 ml/只,共10只,腫瘤長(zhǎng)至1 cm時(shí)取出,制成5×106個(gè)/ml腫瘤細(xì)胞懸液,注于小鼠右前肢腋下0.2 ml/只,造模40只,隨機(jī)分為4組,于接種24小時(shí)后,給予不同的藥物干預(yù),一組不給予處理作為腫瘤對(duì)照組;一組給予CTX(25 mg/kg·d,腹腔注射)作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組(CTX組),其他兩組分別給予丹皮酚低劑量150 mg/kg,高劑量300 mg/kg,腹腔注射,每日1次,連續(xù)14天。每日觀察,隔日稱(chēng)重。

    1.2.2 腫瘤生長(zhǎng)抑制率測(cè)定 14天后,次日脫頸處死小鼠,剖取瘤塊觀察并稱(chēng)重,按公式計(jì)算小鼠腫瘤生長(zhǎng)抑制率:腫瘤生長(zhǎng)抑制率(%)=(對(duì)照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

    1.2.3 腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 取各組小鼠腫瘤組織0.5cm×0.5 cm大小置于4%中性福爾馬林固定液中固定,梯度酒精脫水后,石蠟包埋,組織切片機(jī)切片,蘇木精、伊紅染色,光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化。

    1.2.4 腫瘤組織切片的TUNEL染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟和水合,按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,蘇木精復(fù)染,漂洗脫水,顯微鏡下觀察。鏡下明顯的棕黃色顆粒即是凋亡的細(xì)胞,而藍(lán)色的細(xì)胞提示非凋亡的細(xì)胞,圖像采集應(yīng)用Leica圖像分析軟件,陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)應(yīng)用Leica QWin軟件進(jìn)行計(jì)算。選擇5個(gè)隨機(jī)的視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)100~200個(gè)細(xì)胞。凋亡指數(shù)按公式計(jì)算:凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

    1.2.5 腫瘤組織中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 應(yīng)用Trizol法對(duì)腫瘤組織中的總RNA進(jìn)行提取。電泳觀察RNA提取結(jié)果。1 μg的總RNA用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR反應(yīng)總體積 25 μl,Bcl-2、Bax和 β-actin 引物自行設(shè)計(jì)合成。Bcl-2引物序列 Forward:5'-CCTGGCACCTGGCGGATAGC-3'; Reverse:5'-CGACTGAAGAGTGAGCCCAGCAGAAC-3'長(zhǎng)度529 bp。Bax引物序列Forward:5'-GCTCTGACAGATCATGAAGACAG-3';Reverse:5'-CAATCCAA AGTGGACCTGAGG-3'長(zhǎng)度746 bp。β-actin序列 Forward:5'-AATGGGTCAGAAGGACTCCTATGTGG-3';Reverse:5'-CGCCTAGAAGCACTTGCGGTG-3'長(zhǎng)度 994 bp。Bcl-2 和Bax反應(yīng)條件:95℃、5分鐘,預(yù)變性;94℃、30秒,變性;58℃、30秒,退火;72℃、40秒,延伸,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),72℃、10分鐘,終末延伸,4℃保溫。樣品取出后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),凝膠成像系統(tǒng)掃描分析各條帶,依據(jù)各條帶的光密度和面積對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量分析,以 β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算 Bcl-2/β-actin、Bax/β-actin 的值。

    2 結(jié)果

    2.1 丹皮酚對(duì)小鼠EMT6乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用 各組小鼠不同藥物處理 14天后,發(fā)現(xiàn)CTX和低、高劑量的丹皮酚對(duì)小鼠移植性腫瘤均顯示出明顯的抑制作用。模型對(duì)照組小鼠的平均腫瘤重量為2.58克,而丹皮酚治療組和CTX組小鼠平均瘤重分別為1.48(L)、1.23(H)和1.06克(CTX),比模型對(duì)照組明顯減少(P<0.01);丹皮酚治療組和CTX組的腫瘤抑制率分別是42.64%、52.33%和58.91%。CTX組小鼠體重有所減少,但與對(duì)照組相比,無(wú)顯著差異(P>0.05)。以上結(jié)果表明,CTX與丹皮酚對(duì)小鼠EMT6乳腺癌實(shí)體瘤具有明顯抑制作用(表1)。

    2.2 腫瘤組織的形態(tài)學(xué)觀察 小鼠腫瘤組織切片經(jīng)過(guò)HE染色后,鏡下觀察顯示,腫瘤細(xì)胞在對(duì)照組排列緊密,大小不一,形狀各異,胞漿較少,胞核大并深染,以及明顯的異型性和異常增生(見(jiàn)圖1A)。經(jīng)過(guò)CTX和丹皮酚處理后,腫瘤細(xì)胞數(shù)目明顯減少,核染色質(zhì)聚集于核膜邊緣。核型不規(guī)則,核膜表面粗糙,核碎裂但被核膜包繞,出現(xiàn)凋亡小體,與對(duì)照組相比出現(xiàn)更多的凋亡細(xì)胞(見(jiàn)圖1B、C)。

    表1 丹皮酚對(duì)EMT6小鼠的抑制作用(±s,n=10)Tab.1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s,n=10)

    表1 丹皮酚對(duì)EMT6小鼠的抑制作用(±s,n=10)Tab.1 The inhibitory effect of paeonol on EMT6 solid tumors(±s,n=10)

    Note:1)P<0.01,vs control group.

    Groups Treatment(mg/kg) Body weight Start End Mean weight of tumor(g) Inhibition rate(%)Control — 19.71±1.84 21.18±2.01 2.58±0.46—52.33 CTX 25 20.96±1.72 19.24±1.20 1.06±0.191) 58.91 Paeonol 150 20.17±1.84 21.65±2.59 1.48±0.241) 42.64 300 20.86±1.74 22.57±2.04 1.23±0.271)

    圖1 丹皮酚處理后腫瘤組織形態(tài)學(xué)改變 (H&E,×400)Fig.1 Morphological changes of tumor tissues in the EMT6 model treated with paeonol(H&E,×400)

    圖2 乳腺癌小鼠凋亡形態(tài)學(xué)和凋亡指數(shù)變化(×200)Fig.2 Morphological and apoptotic index changes of apoptosis(×200)

    圖3 腫瘤組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)Fig.3 Expression of Bcl-2 and Bax in tumor tissues

    2.3 腫瘤組織凋亡百分率 應(yīng)用原位凋亡TUNEL染色特異地檢測(cè)了各組小鼠腫瘤組織細(xì)胞凋亡的情況。光鏡下觀察可見(jiàn),模型對(duì)照組可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞大多染成藍(lán)色,即陰性細(xì)胞,僅有少量染成棕黃色的細(xì)胞,如圖2A所示。與對(duì)照組相比,在CTX組和丹皮酚組腫瘤組織切片中出現(xiàn)了更多明顯的棕黃色顆粒,見(jiàn)圖2B、C。經(jīng)過(guò)圖像軟件分析,模型對(duì)照組腫瘤細(xì)胞凋亡率為4.92%,經(jīng)過(guò)CTX和丹皮酚治療后,凋亡率達(dá)到9.94%(CTX)、12.37%(L) 和 21.24%(L)。與對(duì)照組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.4 腫瘤組織Bcl-2和Bax mRNA表達(dá) 應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)了Bcl-2、Bax的mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示,在模型對(duì)照組Bcl-2 mRNA呈過(guò)表達(dá),Bax mRNA呈低表達(dá),CTX組和丹皮酚組的Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯減弱,而B(niǎo)ax表達(dá)卻明顯增強(qiáng)(圖3)。與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。

    3 討論

    乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤,我國(guó)的發(fā)病率正以3%的增長(zhǎng)速度逐年上升,2011年上海、北京、重慶等地的乳腺癌發(fā)病率占當(dāng)?shù)嘏詯盒阅[瘤的首位。當(dāng)前乳腺癌的常用治療手段主要包括傳統(tǒng)的手術(shù)治療以及術(shù)后放化療等,這些手段雖然可以使患者獲得較高的生存率,但是乳腺癌術(shù)后常在幾年內(nèi)復(fù)發(fā)。因此,尋找有效的、副作用小的化療藥物尤其重要。乳腺癌化療藥物的開(kāi)發(fā)過(guò)程中,傳統(tǒng)中藥以其安全性高,副作用小,一直受到患者的青睞,也成為國(guó)內(nèi)外眾多醫(yī)學(xué)工作者和腫瘤學(xué)者研究的方向。

    丹皮酚是從牡丹皮中提取出來(lái)的小分子酚類(lèi)物質(zhì),對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用,因此本文研究了丹皮酚對(duì)乳腺癌的作用和分子機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,丹皮酚能抑制EMT6乳腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞的增殖,腫瘤細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變,出現(xiàn)明顯的凋亡特征,并測(cè)得丹皮酚高劑量組凋亡率為21.24%。由此提示丹皮酚是通過(guò)誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡而起到抗乳腺癌作用。

    細(xì)胞凋亡又稱(chēng)為程序性細(xì)胞死亡,涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控,許多化療藥物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,如紫杉醇、順鉑、長(zhǎng)春新堿等,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也成為腫瘤治療的一個(gè)重要的策略,目前很多藥物的開(kāi)發(fā)和研制都把誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作為藥物療效的一個(gè)衡量指標(biāo)。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)是細(xì)胞在感受到相應(yīng)的信號(hào)刺激后細(xì)胞內(nèi)一系列控制開(kāi)關(guān)的開(kāi)啟或關(guān)閉,不同的外界因素啟動(dòng)凋亡的方式也有所不同,引起的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也不相同。因?yàn)榧?xì)胞類(lèi)型的不同和藥物方面的差異,使藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制非常復(fù)雜。盡管目前對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程中信號(hào)傳遞系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)還不夠全面,但是,線(xiàn)粒體凋亡途徑和細(xì)胞表面死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑是導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡兩個(gè)主要的途徑,而線(xiàn)粒體凋亡途徑被公認(rèn)作為藥物治療癌癥的主要途徑,在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮了主要的作用。線(xiàn)粒體凋亡途徑主要由Bcl-2家族蛋白介導(dǎo),在許多的癌細(xì)胞中,如宮頸癌、乳腺癌、胃癌等,Bcl-2家族蛋白均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。Bcl-2主要發(fā)揮凋亡抑制因子的作用,阻斷細(xì)胞色素C的釋放,而促凋亡成員(Bax)發(fā)揮著促進(jìn)凋亡的作用。目前認(rèn)為,二者的作用通常更依賴(lài)于在Bcl-2和Bax之間的平衡,而并非依賴(lài)于單獨(dú)的Bcl-2或Bax表達(dá)[7,8]。先前的研究顯示,丹皮酚能減少乳腺癌小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明丹皮酚明顯減少腫瘤組織中Bcl-2 mRNA表達(dá),而B(niǎo)ax表達(dá)卻明顯增強(qiáng),進(jìn)而引起B(yǎng)cl-2與Bax的mRNA比值下降。由此推測(cè)丹皮酚通過(guò)抑制或促進(jìn)了Bcl-2和Bax的基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)了Bcl-2和Bax蛋白表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體釋放細(xì)胞色素C,啟動(dòng)了線(xiàn)粒體依賴(lài)途徑。而丹皮酚作用于乳腺癌更詳細(xì)的分子機(jī)制我們將進(jìn)一步的研究和探討。

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