免疫磁珠富集技術(shù)進展①

聞一鳴 徐金亭 向軍儉

(廣東省分子免疫與抗體工程重點實驗室 暨南大學(xué)抗體工程研究中心，廣州510632)

免疫磁珠富集技術(shù)，是以磁性微球作為固相表面，結(jié)合免疫學(xué)方法建立起的一門具有重要應(yīng)用前景的樣品富集手段。具有磁性的微顆粒通過結(jié)合特定抗體，在液相中能特異性地與相應(yīng)抗原結(jié)合，依靠磁場的作用力快速地使所需樣品量得到大大的濃縮。由于免疫磁珠富集法具有快速及特異性強的特點，在三十余年的發(fā)展中，已廣泛應(yīng)用于分離及濃縮特定細(xì)胞、微生物、蛋白質(zhì)和核酸片段等肉眼難以觀察或樣品中含量不高的物質(zhì)。其應(yīng)用也隨著各個科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展而日趨全面和深入[1]。隨著抗體技術(shù)的發(fā)展，免疫磁珠富集技術(shù)已成為細(xì)胞分選和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù)支持。除此，鑒于免疫磁珠富集法有助于降低原有檢測手段的檢測限，其應(yīng)用于食品致病微生物和環(huán)境、食品中小分子毒害物的檢測將大有發(fā)展前景。

1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu)、功能與制備方法

1.1 免疫磁珠的結(jié)構(gòu) 免疫磁珠是一種大小均一，表面具有特定化學(xué)基團的磁性微球。從結(jié)構(gòu)上來說，它分為三部分，核心部分由磁性物質(zhì)構(gòu)成，如γ-Fe2O3、Fe3O4和 MeFe2O3，使磁性微球在磁場作用下能快速聚集;外層由聚苯乙烯、聚乙烯亞胺或聚丙烯酸等高分子材料包裹，保證磁性的密封性良好，不易出現(xiàn)漏磁現(xiàn)象;微球表面還覆蓋有特殊的活化基團，常見的化學(xué)基團有羧基、氨基、巰基、甲苯磺酸基和環(huán)氧基等，能通過共價結(jié)合抗體蛋白上的氨基或羧基基團。近年來，一些商業(yè)機構(gòu)還開發(fā)了表面具有特殊蛋白的磁性微球，如表面具有經(jīng)基因工程改造的A蛋白或G蛋白的磁珠，這些磁珠對普遍抗體Fc區(qū)具有高親和力，能藉此偶聯(lián)抗體的恒定區(qū);又如表面具有鏈霉親和素的磁珠，能與生物素化的抗體緊密結(jié)合，高效地把抗體固定在微球表面。

1.2 免疫磁珠的功能 免疫磁珠的功能主要是通過表面的特異性抗體，在流體力學(xué)作用下，與液態(tài)中的相應(yīng)抗原結(jié)合，并通過多次的磁分離作用，使目的抗原與其余雜質(zhì)徹底分離，從而得到高度濃縮的抗原。根據(jù)磁珠表面偶聯(lián)的不同抗體，免疫磁珠能在短時間內(nèi)富集各種類型的抗原，如分子量極小的核酸、小分子毒素、特異性蛋白、細(xì)胞或致病微生物。這種結(jié)合了物理學(xué)、生物學(xué)和免疫學(xué)的濃縮技術(shù)，使樣品的前處理過程變得簡單，且重復(fù)性較高。

1.3 免疫磁珠的制備 針對擬富集的物質(zhì)制備合適的免疫磁珠，是達(dá)到有效富集的關(guān)鍵所在，也是采用免疫磁珠富集技術(shù)的難點所在。一般來說，制備免疫磁珠的過程需要關(guān)注磁性微球的大小、表面活化基團、抗體的選擇和偶聯(lián)量、封閉及保存等方面[2，3]。

1.3.1 磁珠的選擇 對于磁珠的挑選，一般是針對其粒徑和表面活化基團進行選擇。磁珠的粒徑一般在納米至微米水平，國外常見的商業(yè)用磁珠大小一般在1～4.5 μm之間，屬于體積較大的磁珠，磁性較好，能通過外層大量的活性基團偶聯(lián)抗體，從而結(jié)合體積相當(dāng)?shù)母患a(chǎn)物聚集到磁場下，實現(xiàn)細(xì)胞、病原微生物及其他微米級顆粒的分選和富集[4，5]。而納米級的免疫磁珠每單位重量具有更大的表面積，分散性更好，對磁場的反應(yīng)性極敏捷，適用于醫(yī)學(xué)診斷、治療和高通量分析[6]。

免疫磁珠的制備實質(zhì)上是磁珠表面的活性基團與抗體外部的氨基的結(jié)合過程，這種結(jié)合可以是共價的，也可以是非共價的結(jié)合。當(dāng)抗體與表面帶有羧基、氨基、巰基、甲苯磺酸基和環(huán)氧基等基團的磁珠結(jié)合[6]，則形成較為牢固的共價連接，不容易解離;但這類基團在偶聯(lián)抗體的過程沒有靶向性，會無可避免地結(jié)合在抗體的Fab區(qū)，降低免疫磁珠制備后的富集效果。相反，具有偶聯(lián)靶向性的一些表面活化基團，如A蛋白和G蛋白，能通過非特異性吸附抗體Fc區(qū)，把抗體靶向吸附在磁珠表面，并暴露出與抗原結(jié)合的Fab區(qū);鏈霉親和素活化的磁性微球，則能通過偶聯(lián)Fc區(qū)標(biāo)有生物素的抗體，同樣達(dá)到靶向偶聯(lián)的目的。當(dāng)然，這種通過非共價結(jié)合的偶聯(lián)方式?jīng)]有共價連接的穩(wěn)定性高，在偶聯(lián)過程可通過加入交聯(lián)劑增強偶聯(lián)的穩(wěn)定性。

1.3.2 抗體的選擇及滴度 用于制備免疫磁珠的抗體可以是單克隆抗體也可以是多克隆抗體，單抗對于目的抗原的特異性較好，利于富集后直接用于檢測或分選細(xì)胞[7];多抗的親和力往往高于單抗，易于捕獲抗原，但由于其表位較多，對于富集抗原后的處理，較單抗復(fù)雜。有關(guān)抗體的滴度，一般以ELISA測定結(jié)果為參照，但值得注意的是，磁性微球作為固相載體具有立體結(jié)構(gòu)，比酶標(biāo)板孔的表面積大得多，更利于抗原抗體反應(yīng)，因此在磁珠偶聯(lián)抗體過程中，可以適當(dāng)降低抗體的偶聯(lián)濃度。

1.3.3 偶聯(lián)的條件 抗體與磁珠偶聯(lián)的條件主要是指偶聯(lián)時緩沖液的體系、pH、溫度和反應(yīng)時間等反應(yīng)條件。緩沖液的體系主要依據(jù)磁珠表面活化基團的特點進行選擇，一般選擇離子濃度較低的緩沖體系，并加入0.5%吐溫-20以減少磁珠聚集現(xiàn)象[8];緩沖液pH通常在pH5～pH9.5之間，過酸或過堿都會影響抗體的活性，不建議采用。對于反應(yīng)溫度、時間和環(huán)境，常作為相關(guān)因素考慮。反應(yīng)溫度越低，偶聯(lián)時間越長[9]，常見的反應(yīng)條件是4℃過夜、室溫反應(yīng)3小時或37℃ 1小時。除此，偶聯(lián)的過程必須保持磁珠的良好分散性，為此可以把磁珠置于渦旋攪拌器或旋轉(zhuǎn)儀，防止磁珠的聚集。

1.3.4 免疫磁珠的封閉與保存 制備后的免疫磁珠表面仍存在較多未結(jié)合抗體的位點，因此需要以一些不與抗原反應(yīng)的小分子把表面活性位點封閉，以減少富集過程中的非特異性吸附。常用的封閉劑有BSA、吐溫-20、明膠和甘氨酸。由于BSA和明膠顆粒較其他封閉劑的分子量大，并且在封閉過程會在磁珠表面形成疏水表面，因此適合用于封閉較大的疏水性磁珠，而吐溫-20與甘氨酸則適用于封閉親水性的小磁珠。

2 免疫磁珠富集技術(shù)的優(yōu)勢

2.1 操作步驟簡單省時 在磁場作用下，磁珠-抗體-抗原復(fù)合物能在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)在磁場中聚集，通過去除上清及適當(dāng)洗滌，便可把抗原高效富集(如圖1)，其操作步驟極為簡單，對于試劑、設(shè)備及實驗條件的要求不高，適用于一般實驗室與科研機構(gòu)。與離心、過濾或膜分離等傳統(tǒng)樣品分離程序相比，磁分離技術(shù)利用磁珠作為固相載體，能在同一試管內(nèi)完成擬富集物質(zhì)的分離和洗滌;同樣地，對比液相色譜儀等大型儀器，磁分離也凸顯了其對于設(shè)備要求上的簡便[2]。

圖1 免疫磁珠富集技術(shù)流程圖Fig．1 The procedure of immunomagnetic enrichment technique

2.2 磁珠富集過程高保真 以往常采用離心分離富集、有機溶劑萃取和親和層析等方式對樣品進行提純，對于樣品的活性均存在一定程度的破壞，而且純化的效率也未必很高[9]。離心技術(shù)濃縮樣本是根據(jù)提取物和溶液中其余物質(zhì)存在密度差，從而通過調(diào)整轉(zhuǎn)速分離出提取物。然而，對于成分復(fù)雜的樣品，該方法存在較大的缺陷，除此，離心后的沉淀與上清液難以通過吸取而徹底分離。有機溶劑萃取法則利用不同組分之間溶解度不同的特點進行分離，然而對于成分復(fù)雜的樣品，該方法仍需要先進行樣品預(yù)處理，保證溶液的組分較單一，便于萃取。親和層析法常用于純化蛋白質(zhì)，樣品能通過上柱及洗脫能獲得特異性純化，但偏酸或偏堿性的洗脫環(huán)境往往容易對蛋白質(zhì)的活性造成影響。相比之下，通過磁場作用濃縮樣品的免疫磁珠富集法能使所需物質(zhì)高度濃縮，并且在富集過程，不破壞其生物學(xué)活性。

2.3 高特異性富集 免疫磁性微球表面覆蓋著針對目的抗原的特異性抗體，在液相中能特異性識別抗原表位，并形成抗原抗體復(fù)合物，通過磁聚集與無關(guān)雜質(zhì)分離，并在數(shù)次洗滌中得到純度較高的目的抗原。過去常使用葡聚糖凝膠過濾層析分離并純化樣品中某成分，把分子量在一定范圍內(nèi)的物質(zhì)通過葡聚糖截留，并以鹽離子競爭洗脫，從而收集目的產(chǎn)物。該方法盡管也能起到富集效果，但無可避免地保留著分子量相近的雜質(zhì)。相反，免疫磁珠富集法進一步把富集的純度提升，充分發(fā)揮了免疫學(xué)方法的高特異性優(yōu)勢。

2.4 有助于提高檢測限 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)、免疫熒光和PCR核酸擴增法是常用于檢測微量物質(zhì)的方法，如水樣中的寄生蟲、食物樣品中的致病菌含量和樣品中的病毒含量等[10-15]。然而，盡管這類檢測方法已經(jīng)達(dá)到較高的靈敏度，但對于樣品中濃度極低的檢測物，仍然需要建立一套靈敏度更高的檢測方法。鑒于免疫磁珠富集技術(shù)能從上游的樣品前處理步驟中使目的檢測物濃度大大提高，從而間接地降低了整套檢測方法的檢測限。因此，一系列依靠免疫磁珠富集樣品，并結(jié)合各種檢測技術(shù)的高靈敏檢測方法應(yīng)運而生，使檢測限得以有效降低兩個數(shù)量級或以上[16，17]。

3 免疫磁珠的主要應(yīng)用領(lǐng)域

3.1 細(xì)胞分選及藥物靶向治療 免疫磁珠富集法最早被應(yīng)用于細(xì)胞分選領(lǐng)域，主要有陽性篩選富集和陰性篩選富集法。根據(jù)目的細(xì)胞表面的特定表面抗原(如抗原CD3、CD24等)，以標(biāo)記有相應(yīng)特異性抗體(如抗CD分子的抗體)的磁性微球，從樣品中富集目的細(xì)胞的方法為陽性篩選富集法;相反，用特異性免疫磁珠除去樣品中非目的細(xì)胞的方法即陰性篩選富集法，兩種方法均可根據(jù)樣品應(yīng)用目的的不同富集所需的細(xì)胞。利用磁場分離純化細(xì)胞的方法，可處理血液、骨髓、食物、水樣或土樣等生物類粗提液中的細(xì)胞，且通過這種方法富集的細(xì)胞依然保持良好的生物學(xué)活性，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，而在癌癥的鑒定和治療方面應(yīng)用更是尤為廣泛[18]。

磁性細(xì)胞分選器(Magnetic-assisted cell sorting，MACS)是根據(jù)免疫磁珠富集的原理制成的一種有效進行細(xì)胞分選的新儀器，Tucker等[19]成功應(yīng)用該技術(shù)富集同源的背根神經(jīng)細(xì)胞，Marek等[20]利用CD11b微珠捕獲樣品液中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，也得到了高純度的目的細(xì)胞。MACS也被用于協(xié)助檢測早期肺癌，通過偶聯(lián)有抗CD14與CD16抗體，免疫磁珠能除去痰液中的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，使支氣管上皮細(xì)胞的純度從1.1%提升到40%，從而成為理想的樣品檢測物[21]。結(jié)合MACS和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry，F(xiàn)CM)，也能富集并檢測胃癌細(xì)胞，從而判定患者是否罹患胃癌[22]。磁性的藥物靶向治療以納米微球作為載體，對于癌癥治療具有很好的前景。

目前，結(jié)合了免疫磁珠富集技術(shù)的藥物靶向治療在腫瘤診斷和治療上，具有很好的發(fā)展前景。該治療手段以納米微球為載體，既使患者免受化療帶來的副作用，又提高了治療的效果[23，24]。磁珠和藥物結(jié)合后，在生物機體內(nèi)，能通過外在的磁場作用，準(zhǔn)確地完成藥物在體內(nèi)的空間定位，使藥物聚集到理想作用位點;同時，由于藥物在磁場作用下得到富集，則可減少藥物注入劑量，從而減少藥品的毒性副作用[25]。單克隆抗體常作為靶向藥物偶聯(lián)在納米顆粒上，進入機體后通過抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物，促使靶細(xì)胞被免疫細(xì)胞吞噬或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是先進治療癌癥的有效方法之一。用于藥物靶向治療的納米磁珠由于體積較小(常在10～100 nm之間)，能順利通過通透性較強的新生血管，從而直達(dá)腫瘤位置并留滯[1]。顯然，免疫磁珠富集技術(shù)為體內(nèi)靶向治療打下了良好的基礎(chǔ)，但該技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進一步發(fā)展，仍有賴于更多安全、穩(wěn)定且有效的抗體藥物的成功研制。

3.2 病原微生物的檢測 病原微生物廣泛存在于肉類、乳制品及水樣等物質(zhì)中，對于這些肉眼難發(fā)現(xiàn)的微生物，樣品的前處理是至關(guān)重要的，免疫磁珠富集法與離心、有機溶液萃取和親和層析等傳統(tǒng)樣品前處理方法相比，不僅快速簡單，還提高了檢測的可靠性和靈敏性，因此廣泛應(yīng)用于眾多類型的食品檢測和環(huán)境中的水樣和土壤檢測。

Lee等[26]應(yīng)用免疫磁珠富集法，建立了一種快速檢測淡水和海水水質(zhì)的方法。他們以大腸桿菌和腸球菌含量為檢測指標(biāo)，通過相應(yīng)抗體共價偶聯(lián)羧基活化的磁珠制成免疫磁珠，捕獲水樣中的大腸桿菌或腸球菌，然后通過裂解細(xì)胞釋放出菌體中的ATP，借助熒光素與ATP的顯色反應(yīng)鑒別樣品中是否含有目的菌體。Yang[27]結(jié)合納米磁珠及實時定量PCR技術(shù)，建立了快速檢測營養(yǎng)肉湯和奶制品中單增李斯特菌的一種檢測手段。在實驗中，研究人員通過針對單核細(xì)胞增生李斯特菌的兔屬多抗偶聯(lián)納米磁珠，使樣品中的菌液得到濃縮，再設(shè)計針對該菌的特異性引物，利用實時定量PCR把富集后的樣品進行核算擴增，最終以CT值(Threshold cycles)反映菌含量。該方法能檢測到0.5 ml樣品中含有的≥102個菌落，靈敏度甚高。上述兩種利用免疫磁珠富集法的檢測手段，依然需要對樣品進行前增菌處理，但經(jīng)過磁珠富集，增菌的時間從原來的需時2～3天，縮短為18～24小時，大大提高了檢測的速度，有利于實際應(yīng)用的推廣。對于腸梨硅蟲胞囊、分支桿菌和沙門氏菌等致病菌[28-30]，也可通過磁珠富集法提升整體檢測速度及靈敏度。Lien等[31]以免疫磁珠微流體用于快速檢測甲型流感病毒。其操作較為簡便，只需把帶有藻紅蛋白(一種熒光素)的抗甲型流感病毒的單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)，制備成免疫磁珠后捕獲樣品中的病毒顆粒，然后通過光學(xué)儀器檢測樣品的光強，從而判斷樣品中有無病毒。與只使用流式細(xì)胞術(shù)的檢測手段相比，該方法靈敏度高出1 024倍，并且整個檢測能在15分鐘內(nèi)完成，對比其他方法具有無可比擬的優(yōu)勢。

此外，免疫磁珠富集法還廣泛應(yīng)用于病毒檢測當(dāng)中，它使核酸在提取的過程中免受干擾酶(如RNA酶)和其他雜質(zhì)的影響，確保樣品處理過程的高保真[31]。Willis等[32]結(jié)合免疫磁珠分離技術(shù)及實時定量PCR，檢測牛肉中大腸桿菌O157:H7的含量，該方法較只使用Real-time PCR的靈敏度更高。有研究比對了六種不同的隱孢子蟲DNA提取方案，發(fā)現(xiàn)了采用免疫磁珠富集法提取的核酸片段，經(jīng)過PCR及電泳鑒定后，條帶最清晰，且陽性率最高[33]。

3.3 小分子抗原的濃縮 免疫磁珠富集技術(shù)可應(yīng)用于濃縮一些半抗原小分子物質(zhì)的富集，如水樣或食品中的毒素和重金屬等危害物。據(jù)報道，特異性的免疫磁珠能富集蓖麻毒素，借助光譜學(xué)技術(shù)，在20分鐘以內(nèi)便可檢測出存在于牛奶中的蓖麻毒素，檢測限達(dá)到 4 μg/ml[34]。Yang 等[35]制備了表面偶聯(lián)有抗氯霉素的磁性微球，成功地從蝦樣品中提取出氯霉素。該項研究通過儀器分析免疫磁珠與抗原結(jié)合后的磁性減少量，從而判斷抗原的結(jié)合率，更直觀地展現(xiàn)了免疫磁珠的富集優(yōu)勢。目前，有關(guān)免疫磁珠用于富集小分子物質(zhì)的研究仍不多見，主要是因為制備相關(guān)抗體難度較大且研發(fā)周期較長。鑒于近年來有關(guān)小分子毒物的污染事件愈發(fā)突出，許多科研機構(gòu)已研發(fā)出針對毒素或各類重金屬的高效價抗體[36-38]，為免疫磁珠富集技術(shù)在這領(lǐng)域的應(yīng)用打下了良好的基礎(chǔ)。

3.4 蛋白質(zhì)分析 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的興起，免疫磁珠富集手段更多地被用于尋找并富集特定細(xì)胞株里的生物標(biāo)記物。這些在細(xì)胞上清中含量較低的蛋白質(zhì)，能被偶聯(lián)了特異性抗體的磁珠捕獲，并通過質(zhì)譜分析鑒定。Aqai Payam等[39]利用超順磁性微球偶聯(lián)單克隆抗體，對存在于谷物中的真菌毒素蛋白進行分選，并結(jié)合液相色譜技術(shù)準(zhǔn)確檢測。通過免疫磁珠富集技術(shù)，初始含量極低的生物標(biāo)記物得以高效濃縮并通過質(zhì)譜被鑒定出來。Nylandsted等[40]利用免疫磁珠濃縮技術(shù)純化溶酶體，比較正常狀態(tài)下和癌癥狀態(tài)下溶酶體的性質(zhì)差異，從而發(fā)現(xiàn)了原癌基因ErbB2的異位表達(dá)，導(dǎo)致了溶酶體膜蛋白質(zhì)組發(fā)生顯著性差異，最終使癌細(xì)胞高度擴散。Careri等[41]則把免疫磁珠富集方法應(yīng)用于收集樣品中濃度較低的花生過敏原蛋白，他們利用表面連有Protein A的磁性微粒偶聯(lián)特異性單抗，直接從樣品中富集到抗原Ara h3/4花生蛋白。

4 展望

免疫磁珠的發(fā)展至今已30余年，在眾多科研工作者的努力下，免疫磁珠的應(yīng)用日漸廣泛及成功。國外商業(yè)用的免疫磁珠生產(chǎn)已走向穩(wěn)定化和多元化發(fā)展，科研單位也能根據(jù)自身需要，采用化學(xué)方法合成所需的免疫磁珠。

目前，對于免疫磁珠的制備已有較為豐富的理論及實踐依據(jù)，但抗體在偶聯(lián)磁珠后活性、親和力和效價有所降低往往會影響下游技術(shù)應(yīng)用的效果，成為制約此富集技術(shù)應(yīng)用的一個關(guān)鍵因素。因此，優(yōu)化免疫磁珠制備方法，確保抗體偶聯(lián)后保持良好活性和親和力是應(yīng)用此項富集技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。除此，免疫磁珠在捕獲抗原后，如何有效地解吸附，順利進入下一環(huán)節(jié)的應(yīng)用也是免疫磁珠富集技術(shù)在結(jié)合其他領(lǐng)域技術(shù)時所要關(guān)注的。

免疫磁珠富集技術(shù)所具備的特異性強、快速、操作簡便及重復(fù)性強等多個優(yōu)勢必將給科研帶來更多的便捷，過去在細(xì)胞分選領(lǐng)域的應(yīng)用已得到廣泛的成功，并為眾多科研機構(gòu)所推行。今后，免疫磁珠富集技術(shù)將更多地應(yīng)用于病原微生物檢測、藥物靶向治療、分子生物學(xué)領(lǐng)域及蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，對于已有的樣品檢測方法及生物醫(yī)學(xué)的藥物研究注入新的動力。

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