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    IL-17等炎性因子在風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少骨髓細(xì)胞中的分泌狀態(tài)及其臨床意義①

    2013-11-27 11:15:34孫黎飛孫志宏吳強(qiáng)強(qiáng)張曉席杜延會(huì)王桂臣
    中國(guó)免疫學(xué)雜志 2013年1期
    關(guān)鍵詞:抗人血細(xì)胞皮質(zhì)激素

    孫黎飛 孫志宏 吳強(qiáng)強(qiáng) 張曉席 杜延會(huì) 王桂臣

    (解放軍第148醫(yī)院腫瘤中心,淄博255300)

    隨著對(duì)風(fēng)濕免疫性疾病的認(rèn)識(shí)和研究不斷提高,風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(Rheumatism immune-related hematocytopenia,RIRH)的發(fā)病率也逐年增高。我們以往的研究發(fā)現(xiàn),部分RIRH患者伴有血清HLA-B27升高,且端粒酶活性增強(qiáng),較之血清HLAB27陰性者造血細(xì)胞損傷更加嚴(yán)重[1,2],在血清 IgG升高的患者骨髓中伴有不同造血細(xì)胞島出現(xiàn)[3]。本文進(jìn)一步觀察了該類患者血清中炎性因子的含量和骨髓中免疫細(xì)胞表達(dá)炎性因子的狀態(tài),探討其與RIRH骨髓造血細(xì)胞損傷的關(guān)聯(lián)和臨床診療的意義。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 66例RIRH為2009年~2012年我院診治患者,男性20例,女性46例,年齡范圍36~72歲;全血細(xì)胞減少32例,兩系減少34例。外周血WBC(0.7~3.2)×109L-1,HB(35~102)g/L,PLT(30~238)×109L-1;其中伴有干燥綜合征者19例,類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎30例,風(fēng)濕性心臟病17例。27例WBC<2.0×109L-1,伴肺部或尿路感染者血清IgG和血沉(ESR)顯著增高。21例間斷服用糖皮質(zhì)激素,28例伴血清HLA-B27增高(影像學(xué)排除強(qiáng)直性脊柱炎)。血清對(duì)照組30人選自我院查體中心健康標(biāo)本,年齡20~50歲,男性15人,女性15人。

    1.2 主要試劑和器材 血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ酶免(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司,羊抗人HLA-DR單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Beyotime公司,羊抗人IgG抗體、驢抗羊IgG熒光二抗(Cy3)、小鼠抗人FcγⅡR、羊抗小鼠IgG熒光二抗(FITC)、小鼠抗人甘露糖受體(Mannose receper,MR,PE)、ICAM-1(PE)、IL-12(AF488)、IL-17A(FITC)和IL-17RA(PE)單克隆免疫熒光(Immunofluorescence,IF)抗體均購(gòu)自美國(guó)SANTA公司。

    1.3 檢測(cè)血清細(xì)胞因子含量 留取患者空腹靜脈血清,-80℃保存,1周內(nèi)ELISA方法檢測(cè)其治療前后血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 含量,每孔標(biāo)本設(shè)3孔,波長(zhǎng)450nm讀取3孔OD均值,標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣品濃度。

    1.4 分析骨髓免疫細(xì)胞活化狀態(tài)和免疫分子表達(dá)留取患者治療前和治療4周后骨髓涂片,聯(lián)苯胺法過(guò)氧化物酶(Peroxydase,POX)染色,觀察免疫細(xì)胞POX活性;免疫化學(xué)(IC)法檢測(cè)免疫細(xì)胞HLADR抗原表達(dá),IF法檢測(cè)骨髓細(xì)胞抗人IgG抗體、FcγⅡR、MR、ICAM-1、IL-12、IL-17A 和 IL-17RA 等免疫分子表達(dá),缺鐵性貧血骨髓片為疾病對(duì)照。

    1.5 藥物治療原則

    1.5.1 免疫抑制劑和對(duì)癥支持 ①根據(jù)患者病情予以糖皮質(zhì)激素治療,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡,抑制免疫細(xì)胞活化;至血象恢復(fù)后,逐漸遞減;血清HLA-B27和血清IgG升高者,及時(shí)聯(lián)合環(huán)孢素A(CsA)口服,抑制T輔助細(xì)胞活化。②伴有感染灶,發(fā)熱、WBC顯著下降者,根據(jù)藥敏選擇抗生素和(或)聯(lián)合抗病毒藥物治療。③原發(fā)病和對(duì)癥支持治療。

    1.5.2 復(fù)方丹參干預(yù)改善骨髓血管炎性病變 32例血小板計(jì)數(shù)>50×109L-1,無(wú)出血傾向者在上述治療方案同時(shí)聯(lián)合復(fù)方丹參(四川和升制藥)30 ml/qd靜滴,促進(jìn)患者體內(nèi)和骨髓造血微環(huán)境炎性因子的清除,隨機(jī)抽取未加復(fù)方丹參治療組30例RIRH作為治療對(duì)照組,兩組年齡范圍、性別比例和病情基本相似。每周復(fù)查兩組患者血清IL-5和IL-17含量及外周血象,4周后隨訪兩組骨髓象變化。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),率的比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 RIRH患者血清中多種炎性因子升高 患者入院時(shí)血清 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17 和 IFN-γ 分別為(126.04±7.66)ng/L、(316.23±25.163)ng/L、(328.43±27.01)ng/L、(48.17±4.22)ng/L和(40.28±3.69)ng/L,較之對(duì)照組顯著升高,P值均<0.05。經(jīng)藥物治療4周至血象恢復(fù)時(shí),上述細(xì)胞因子分別下降至(58.21±5.14)ng/L、(188.13±12.51)ng/L、(96.01±6.76)ng/L、(26.01±4.23)ng/L和(9.13±2.55)ng/L,接近對(duì)照組(詳見(jiàn)表1),P>0.05。66例患者中IL-5和IL-17升高率為100%(66/66),IL-12 升高率為 97.0%(64/66),而IL-10和 IFN-γ升高率分別為66.67%(44/66)和69.69%(46/66),較前者差異顯著,P<0.05。

    2.2 RIRH患者骨髓免疫細(xì)胞活化特點(diǎn)

    2.2.1 組織嗜堿細(xì)胞(肥大細(xì)胞,Mast cell,MC)增多與IL-10升高密切相關(guān) 患者骨髓中MC數(shù)量增多,分類約為(3.2±0.08)%,顯著高于疾病對(duì)照組(0.6±0.05)%,P<0.05;活化的MC通過(guò)粘附、捕獲和釋放嗜堿性顆粒攻擊病變血細(xì)胞(圖1 A~D),且與血清IL-10升高水平密切相關(guān)r=0.885。

    2.2.2 嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophile granulocyte,EOS)增生活躍 患者骨髓中EOS分類約為(7.4±3.1)%,高于對(duì)照組(2.4±1.6)%,P<0.05?;罨腅OS特異性顆粒POX活性增強(qiáng),粘附、捕獲和吞噬著病變的中性粒細(xì)胞(圖1E)、血小板(圖1F箭頭)和紅細(xì)胞(圖1G箭頭),被攻擊的病變中性粒細(xì)胞POX活性顯著減弱(圖1H箭頭)。

    2.2.3 巨噬細(xì)胞(Mφ)形態(tài)奇異 部分患者由于間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素,其骨髓中POX陽(yáng)性形態(tài)怪異的Mφ(圖2A~C)多見(jiàn),伴有感染者骨髓中可見(jiàn)到巨大活化狀態(tài)的Mφ募集各種炎性細(xì)胞現(xiàn)象(圖2D)。

    2.2.4 伴有感染者免疫細(xì)胞高表達(dá)HLA-DR 活化狀態(tài)的 DC(圖2E)、Mφ(圖2F)和 MC(圖 2G)HLA-DR呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。伴感染者骨髓造血細(xì)胞島中高表達(dá)HLA-DR的巨大Mφ捕獲病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn)(圖2H)。間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療者,骨髓中約1/2的DC、Mφ不表達(dá)HLA-DR。

    2.2.5 RIRH患者骨髓中免疫細(xì)胞捕獲表達(dá)抗人IgG病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn) 部分病變的血細(xì)胞膜抗人IgG IF呈帶狀陽(yáng)性,EOS(圖2A)和MC(圖2B)特異性顆粒結(jié)合大量抗人IgG IF,活化的DC(圖2C)和Mφ粘附捕獲病變血細(xì)胞現(xiàn)象多見(jiàn);血清IgG顯著升高者骨髓中,造血細(xì)胞島中Mφ與病變血細(xì)胞連接處大量抗人IgG IF沉積(圖2D),對(duì)照組骨髓造血細(xì)胞膜抗人IgG IF陰性。

    2.2.6 RIRH患者骨髓中活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)FcγⅡR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中Mφ低表達(dá)FcγⅡR(圖3F),伴有感染血清IgG升高的RIRH患者骨髓中,活化的Mφ表達(dá)FcγⅡR的數(shù)量顯著增多(圖3G),與病變的造血細(xì)胞結(jié)合形成巨大的Mφ型造血細(xì)胞島多見(jiàn)(圖3H),提示感染加重造血損傷?;罨腄C不表達(dá)FcγⅡR,而EOS則強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖3E)。

    2.2.7 RIRH患者骨髓中活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)MR 缺鐵性貧血和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者骨髓中DC和Mφ呈顆粒狀弱表達(dá)MR(圖3J),伴有感染的RIRH患者骨髓中DC(圖3I)、EOS(未顯示)和Mφ(圖3K)表達(dá) MR的數(shù)量顯著增多,在 IgG和ESR升高的全血細(xì)胞減少RIRH患者骨髓中,由高表達(dá)MR的Mφ與病變血細(xì)胞組成的造血細(xì)胞島多見(jiàn)(圖3L),提示造血損傷加重。

    表1 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果(ng/L)Tab.1 Serumal level of cytokines(ng/L)

    圖1 RIRH患者骨髓中活化的組織嗜堿細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞(×1 000)Fig.1 Activated tissue basophil and eosinophil in bonemarrow of RIRH patients( ×1 000)

    圖2 RIRH患者骨髓中奇異的Mφ和免疫細(xì)胞HLA-DR表達(dá)情況(×1 000)Fig.2 Weird expression of HLA-DR on Mφ and other immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

    圖3 RIRH患者骨髓中免疫細(xì)胞表達(dá)IgG、FcγⅡR和MR(×1 000)Fig.3 IgG,F(xiàn)cγⅡR and MR were observed to be expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients( ×1 000)

    2.2.8 感染促進(jìn)粘附分子ICAM-1表達(dá) 伴有感染的RIRH患者骨髓中活化的DC(圖4A)、EOS(圖4B)和Mφ(圖4C)高表達(dá)粘附分子ICAM-1,缺鐵性貧血與間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的RIRH患者,上述免疫細(xì)胞呈顆粒狀弱表達(dá)ICAM-1(圖4D),提示感染可上調(diào)粘附分子表達(dá),促進(jìn)免疫細(xì)胞參與對(duì)造血細(xì)胞的炎性反應(yīng)過(guò)程。

    2.2.9 RIRH患者骨髓免疫細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-17A及其受體 骨髓中DC(圖4E)、EOS(圖4F)和Mφ(圖4G)胞漿中呈分泌狀表達(dá)IL-12,缺鐵性貧血患者骨髓中DC和EOS不/弱表達(dá),Mφ呈灶性弱表達(dá)(圖4H)。缺鐵性貧血和血清IgG升高骨髓呈體液免疫活化優(yōu)勢(shì)狀態(tài)的RIRH患者骨髓中,DC不表達(dá)IL-17A,而在血清HLA-B27升高的RIRH患者骨髓中,活化的DC(圖4I)、EOS(圖4J)和Mφ(圖4K)均高表達(dá)IL-17A,缺鐵性貧血患者骨髓中僅少量造血細(xì)胞表達(dá)IL-17RA,伴有感染的RIRH患者骨髓細(xì)胞中廣泛表達(dá)IL-17RA(圖4L),提示感染使IL-17A與IL-17RA結(jié)合的細(xì)胞數(shù)量增多,能放大由其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

    2.3 藥物治療效果

    2.3.1 經(jīng)糖皮質(zhì)激素聯(lián)合抗感染等藥物治療1周后,患者血清IgG和ESR逐漸下降,血象逐漸恢復(fù)直至正常。伴有HLA-B27升高全血細(xì)胞減少的RIRH患者血象恢復(fù)遲緩,經(jīng)聯(lián)合CsA治療4周后,患者血象開(kāi)始恢復(fù);復(fù)查骨髓可見(jiàn)EOS的POX活性減弱,Mφ核凋亡現(xiàn)象多見(jiàn),2/3的 DC和 Mφ HLA-DR轉(zhuǎn)陰。

    圖4 免疫細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、IL-12、IL-17A和IL-17RA(×1 000)Fig.4 ICAM-1,IL-12,IL-17A and IL-17RA were expressed by immunocyte in marrow of RIRH patients(×1 000)

    圖5 聯(lián)合復(fù)方丹參治療對(duì)患者血清炎性因子清除的動(dòng)態(tài)觀察Fig.5 The analysis of compound Salvia miltiorrhiza to remove serumal inflammatory factors

    2.3.2 復(fù)方丹參聯(lián)合免疫抑制劑治療能促進(jìn)患者血清炎性因子清除 32例RIRH聯(lián)合復(fù)方丹參治療2周以后,血清IL-5和IL-17含量較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組顯著降低(圖5),血象恢復(fù)時(shí)間較之未聯(lián)合復(fù)方丹參組提前1周,骨髓中表達(dá)IL-17A和IL-17RA的免疫細(xì)胞及造血細(xì)胞比例,較之對(duì)照組顯著減少。兩組間差異顯著,P<0.05。

    3 討論

    風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病是各種致病因素誘發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)自身成分發(fā)生免疫應(yīng)答而導(dǎo)致的自身免疫性疾病狀態(tài)。患者體內(nèi)存在針對(duì)自身成分產(chǎn)生的自身抗體和/或自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞,能介導(dǎo)對(duì)自身細(xì)胞或組織成分獲得性免疫應(yīng)答。由于疾病慢性遷延和反復(fù)發(fā)作,以及自身抗體的分子模擬和抗原表位擴(kuò)展,最終累及造血系統(tǒng),致使患者體內(nèi)部分血細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)改變,引發(fā)了針對(duì)病變血細(xì)胞(靶細(xì)胞)的風(fēng)濕免疫相關(guān)性血細(xì)胞減少(RIRH)超敏反應(yīng)病理過(guò)程和疾病狀態(tài),感染免疫活化能加重對(duì)造血細(xì)胞的免疫損傷作用[4]。

    我們的研究發(fā)現(xiàn),該類患者除伴有自身免疫性疾病外,臨床主要表現(xiàn)為外周血兩系或三系(全血細(xì)胞)減少,骨髓增生活躍,組織嗜堿細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞活化。部分患者由于間斷服用糖皮質(zhì)激素,骨髓中漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞形態(tài)異常,功能受抑。而伴WBC減少的患者骨髓中,活化的嗜酸性粒細(xì)胞攻擊POX活性減弱或消失的病變中性粒細(xì)胞現(xiàn)象增多,是RIRH患者重要的骨髓特征,同時(shí)也提示嗜酸性粒細(xì)胞在RIRH造血細(xì)胞損傷病理過(guò)程中,起到至關(guān)重要的作用。

    我們的研究結(jié)果顯示,RIRH患者由于長(zhǎng)期處于免疫紊亂狀態(tài),其血清中 IL-5、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ等多種與自身免疫相關(guān)聯(lián)的炎性因子升高,其中促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞增殖的IL-5和作為炎性介質(zhì)的IL-17的升高率為100%,而活化細(xì)胞免疫的炎性因子IL-12升高率為97.0%,表明這些介導(dǎo)自身免疫性炎性因子與RIRH造血細(xì)胞炎性損傷的病理過(guò)程密切關(guān)聯(lián)[5,6]。

    我們的研究結(jié)果還顯示,由于患者體內(nèi)存在針對(duì)自身病變?cè)煅?xì)胞膜的IgG抗體,其骨髓中部分病變血細(xì)胞膜抗人IgG IF陽(yáng)性表達(dá),誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生,由于原發(fā)病導(dǎo)致患者體內(nèi)免疫紊亂狀態(tài),多種免疫細(xì)胞活化,以不同方式攻擊病變血細(xì)胞,是RIRH骨髓造血細(xì)胞病理性損傷重要的特征。部分患者由于WBC減少和間斷應(yīng)用糖皮質(zhì)激素,極易并發(fā)感染加重病情?;颊吖撬柚芯奘杉?xì)胞可上調(diào)表達(dá)FcγⅡR和 MR,介導(dǎo) ADCC效應(yīng);上調(diào) ICAM-1表達(dá),促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)病變血細(xì)胞的粘附、捕獲和吞噬,是患者造血細(xì)胞破壞的重要方式[7-9]。

    我們的研究發(fā)現(xiàn),RIRH患者骨髓中,活化的免疫細(xì)胞高表達(dá)IL-12和IL-17A,提示其可能具有分泌這些炎性介質(zhì)的功能;能通過(guò)介導(dǎo)骨髓造血微環(huán)境的血管炎性病變,影響造血細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,損傷和破壞病變?cè)煅?xì)胞,亦為該類患者骨髓造血細(xì)胞破壞的另一重要因素。

    藥物治療結(jié)果及IL-5和IL-17追蹤分析指標(biāo)表明,在抗感染、應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和CsA等藥物,抑制免疫細(xì)胞對(duì)造血細(xì)胞破壞作用同時(shí),對(duì)血小板>50×109L-1無(wú)出血傾向患者,謹(jǐn)慎聯(lián)合復(fù)方丹參等活血化瘀藥物治療,有利于炎性因子的代謝和清除,改善骨髓造血微環(huán)境,促進(jìn)疾病恢復(fù)。

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