以1,4-二甲基咔唑-9-丙酸為熒光衍生化試劑高效液相色譜法測(cè)定醇

勞文劍，宋翠華，尤進(jìn)茂，歐慶瑜

(1.中國(guó)科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所，甘肅 蘭州 730000; 2. 曲阜師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，山東 曲阜 273165)

醇在飲料、食品、藥物和生物體中廣泛存在，也廣泛用于制藥、化妝品和表面活性劑等工業(yè). 甾體、碳水化合物對(duì)于生物體有著重要作用，因而它們都是重要的分離分析對(duì)象. 脂肪醇、甾體、碳水化合物等沒有紫外吸收，用HPLC對(duì)它們進(jìn)行高靈敏的熒光檢測(cè)一般需經(jīng)衍生化[1]. 衍生化羥基主要用酰化反應(yīng)，生成酯、氨基甲酸酯、磺酰酯等[2-7]. 例如，應(yīng)用2,4,6-三甲苯磺酰氯和2,4,6-三異丙基苯磺酰氯作縮合劑直接用于醇和酸的縮合已有報(bào)道，然而由于縮合劑的位阻作用，使反應(yīng)活性及酰化產(chǎn)率不理想，而且縮合反應(yīng)必須在較高溫度下進(jìn)行. 應(yīng)用酸酐進(jìn)行縮合反應(yīng)通常須在40～100 ℃下完成，并且在潮濕的環(huán)境下酸酐不穩(wěn)定[8].

本文作者報(bào)道以間苯二磺酰氯作縮合劑，利用1,4-二甲基咔唑-9-丙酸與間苯二磺酰氯的混合酸酐用于醇的熒光衍生化. 醇和1,4-二甲基咔唑-9-丙酸熒光試劑反應(yīng)形成穩(wěn)定的熒光衍生物. 所用縮合劑間苯二磺酰氯為固體，易稱量，潮濕環(huán)境下穩(wěn)定，與2,4,6-三甲苯磺酰氯和2,4,6-三異丙基苯磺酰氯對(duì)比，反應(yīng)時(shí)位阻小、活性高，試劑與醇縮合產(chǎn)率高，條件溫和不需加熱處理[4].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HITACHI 655型高效液相色譜儀(日本) ，配備651-10S熒光分光光度計(jì)，644-61積分儀、U2型電磁恒溫槽.

三乙胺、吡啶(分析純)和乙腈(分析純)以5A分子篩干燥，用前經(jīng)過蒸餾處理. 磷酸二氫銨(分析純)，購自山東濟(jì)寧化學(xué)試劑公司，C1-C9、C12、C18醇(分析純)購自山東濟(jì)寧化學(xué)試劑公司，膽固醇購自北京化學(xué)試劑公司，其他溶劑皆為分析純購自濟(jì)寧化學(xué)試劑公司. 1,4-二甲基咔唑-9-丙酸按文獻(xiàn)[9]合成，間苯二磺酰氯按文獻(xiàn)[4]合成. 1,4-二甲基咔唑-9-丙酸的二氯甲烷溶液為1×10-2mol/L，間苯二磺酰氯的二氯甲烷溶液為1.1×10-2mol/L，4-N,N-二甲基氨基吡啶(DMAP)的乙腈溶液為1.2×10-2mol/L，醇的二氯甲烷溶液為3.0×10-3mol/L.

1.2 色譜條件

色譜柱：200 mm×4.6 mm ID，5 μm Spherisord C18 (大連化學(xué)物理研究所). 柱溫：室溫. 熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫10 nm. 激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)：λex= 292 nm，λem= 372 nm. 流動(dòng)相A為體積比30/70的乙腈/水溶液，其中包括20 mmol/L的磷酸二氫銨、18 mmol/L的三乙胺，pH = 6.5，B為體積比95/5的乙腈/水溶液. 分離衍生物的梯度條件為: 0 min, 100% A; 20 min, 30% A; 25 min, 20% A; 30 min, 1% A. 流速：1.0 mL/min.

1.3 優(yōu)化的醇的衍生化過程

制備混合酸酐：在2 mL二氯甲烷中依次加入5.4 mg (0.02 mmol)1,4-二甲基咔唑-9-丙酸、 6.0 mg (0.022 mmol)間苯二磺酰氯和2.9 mg (0.024 mmol) DMAP，搖勻后，室溫下放置30 min. 反應(yīng)液不經(jīng)處理可直接進(jìn)行下一步反應(yīng). 在1 mL混合酸酐二氯甲烷溶液中，加入1.8 mg DMAP和1 mL醇的二氯甲烷溶液. 使混合均勻，10 min后取出10 μL反應(yīng)液，用N2吹干，殘余物溶解在100 μL乙腈中，取5 μL進(jìn)樣分析. 衍生化反應(yīng)式見圖1.

圖1 混合酸酐衍生化醇的反應(yīng)式Fig.1 Scheme of mixed acid anhydride to derive alcohol

1.4 血清樣品的預(yù)處理

在10 mL離心管中加入270 μL血清，依次加入30 μL水和100 μL 0.1 mol/L KOH溶液，在超聲波下處理30 s，使酸性化合物轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的鹽，加入200 μL二氯甲烷充分混合，室溫下放置30 min，移取有機(jī)相. 殘余物再用200 μL二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷分別以0.1 mol/L HCl和去離子水洗滌以除去游離胺類化合物. 100 μL二氯甲烷萃取物用于衍生化.

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生化條件

為了找到最佳的衍生化條件，以正戊醇為對(duì)象，研究了不同溶劑、催化劑、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等對(duì)衍生化效果的影響.

分別以丙酮、乙腈、氯仿、二氯甲烷、DMF、乙酸乙酯為反應(yīng)的共溶劑，按實(shí)驗(yàn)部分所述的衍生化步驟制備混合酸酐和進(jìn)行衍生化反應(yīng)，以二氯甲烷為溶劑的衍生物的熒光強(qiáng)度為100%進(jìn)行比較，結(jié)果是二氯甲烷(100%) > 氯仿(95%) > 乙腈 (32%) > 乙酸乙酯 (25%) > 丙酮 (20%) > DMF (10%). 表明衍生化的溶劑以二氯甲烷為最佳，氯仿次之. 因此，衍生化采用二氯甲烷為溶劑.

實(shí)驗(yàn)證明，沒有堿催化劑，則衍生化反應(yīng)不能進(jìn)行. 對(duì)DMAP、吡啶、三乙胺、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶的催化效果進(jìn)行了考察. 以DMAP為催化劑的衍生物的熒光強(qiáng)度為100%進(jìn)行比較，結(jié)果是DMAP (100%) > 三乙胺(37.5%) > 吡啶(31.5%) > 3-甲基吡啶(25%) > 2-甲基吡啶(6.5%). 可以看出，DMAP的催化效果最好.

在0～40 ℃溫度范圍內(nèi)對(duì)衍生產(chǎn)率(檢測(cè)響應(yīng))進(jìn)行了研究，最佳衍生溫度為25～30 ℃，低于25 ℃反應(yīng)速率明顯偏低，高于30 ℃反應(yīng)產(chǎn)率有下降趨勢(shì)(圖2). 衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)率有影響，衍生化反應(yīng)的產(chǎn)率在10 min以后就基本穩(wěn)定(圖2). 制備的混合酸酐溶液可密封放置至少一周，其活性不會(huì)減小. 為了評(píng)價(jià)衍生物的穩(wěn)定性，將所得衍生物每隔6 h分析一次，結(jié)果表明衍生物檢測(cè)響應(yīng)信號(hào)24 h內(nèi)基本穩(wěn)定 (圖2).

圖2 衍生化反應(yīng)參數(shù)對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of derivatization parameters on fluorescence intensity

2.2 衍生直鏈脂肪伯醇、二級(jí)醇和三級(jí)醇

分別對(duì)C1-C9的直鏈脂肪伯醇和C12和C18兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪伯醇進(jìn)行了衍生化實(shí)驗(yàn)，取得了較好的效果(圖3). C1-C9直鏈脂肪伯醇的保留時(shí)間分別為(min)：C116.882, C218.052, C320.523，C422.338, C524.262, C626.097, C727.885, C829.505, C931.06. C12和C18兩個(gè)長(zhǎng)鏈脂肪伯醇以及內(nèi)標(biāo)正庚醇(C7)的保留時(shí)間分別為(min)：C729.863, C1235.027, C1838.254.

分別對(duì)異丙醇、異丁醇、叔丁醇、異戊醇和環(huán)己醇以及膽固醇進(jìn)行了衍生化實(shí)驗(yàn)，圖4中峰的保留時(shí)間(min)：1, 異丙醇19.563; 2, 叔丁醇21.06; 3, 異丁醇23.075; 4, 異戊醇24.538; 5,環(huán)己醇25.397; 6, 膽固醇 32.475. 結(jié)果表明，1,4-二甲基咔唑-9-丙酸和間苯二磺酰氯混合酸酐法對(duì)仲醇和叔醇都有衍生化能力，特別是對(duì)膽固醇的衍生，用于生物樣品是有意義的.

左圖：C1-C9醇. 右圖：C12，C18醇，正庚醇(C7)為內(nèi)標(biāo)圖3 直鏈脂肪伯醇衍生物的色譜圖Fig.3 Chromatograms of straight-chain aliphatic primary alcohol derivatives

左圖: 1, 異丙醇; 2, 叔丁醇; 3, 異丁醇; 4, 異戊醇; 5, 環(huán)己醇. 右圖: 6, 膽固醇圖4 二級(jí)醇和三級(jí)醇衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of secondary and tertiary alcohol derivatives

2.3 線性范圍和檢測(cè)限

配制0.4～1 000 μmol/L的C1-C9醇的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行衍生然后進(jìn)行色譜分析，結(jié)果表明在此范圍內(nèi)，大部分醇有著良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)大于0.995，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，線性范圍和檢測(cè)限見表1.

表1 衍生C1-C9直鏈伯醇的線性范圍和檢測(cè)限Table 1 Linear ranges and detection limits of straight-chain aliphatic primary alcohol (C1-C9) derivatives

2.4 方法應(yīng)用

對(duì)人血清中游離醇的測(cè)定結(jié)果見表2. 譜圖見圖5.

表2 血清中游離醇的測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of free alcohol in human serum

圖中C1：甲醇(16.075min)，C2：乙醇(18.827min)，C3：正丙醇(19.917 min)圖5 血清中游離醇的色譜圖Fig.5 Chromatograms of free alcohol derivatives in human serum

結(jié)論:1,4-二甲基咔唑-9-丙酸與間苯二磺酰氯生成的混合酸酐，能夠?qū)κ藗€(gè)碳以下的直鏈脂肪伯醇、六個(gè)碳以下的仲醇和叔丁醇進(jìn)行衍生，還能夠衍生膽固醇. 衍生化反應(yīng)在室溫下即可完成，條件溫和，操作簡(jiǎn)便. 衍生產(chǎn)物在反相液相色譜條件下可獲得較理想的分離，適合醇類化合物的分析.

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