參與小RNA病毒感染和復(fù)制的宿主及病毒蛋白功能研究進(jìn)展

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小RNA病毒是自然界中普遍存在的一大類動(dòng)物病毒。該病毒科的某些成員因嚴(yán)重影響著人類的健康而被人熟知。小RNA病毒科包括5個(gè)屬，分別是腸道病毒屬、鼻病毒屬、心病毒屬、口蹄疫病毒屬和肝病毒屬。小RNA病毒是二十面體、單股正鏈，基因組約7 500個(gè)核苷酸的RNA病毒，同時(shí)其基因組包括一個(gè)65～100nt的3′poly（A）尾?；蚪MRNA 5′端連接有病毒編碼的多肽VPg，因VPg在細(xì)胞內(nèi)被快速降解，因此大多數(shù)病毒轉(zhuǎn)錄本缺少VPg。小RNA病毒基因組沒有帽子結(jié)構(gòu)（m7GpppN）。病毒RNA編碼一個(gè)大的多聚前蛋白，然后由病毒編碼的蛋白酶的加工后變?yōu)槌墒斓牟《镜鞍住Ｆ渲械?種（VP1－VP4）組成病毒的衣殼蛋白，其余蛋白參與病毒的復(fù)制。

小RNA病毒對細(xì)胞的感染是個(gè)高效、多效應(yīng)的過程。為了完成病毒的整個(gè)生命周期，病毒蛋白參與了病毒的復(fù)制、翻譯，同時(shí)改變了宿主細(xì)胞的功能，如細(xì)胞中的基因表達(dá)，蛋白質(zhì)的定位，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，膜的重排。本文著重綜述了小RNA病毒感染和復(fù)制過程中參與的病毒蛋白和宿主蛋白的功能。

1 受體結(jié)合過程中參與的衣殼蛋白和宿主蛋白

小RNA病毒基因組P1區(qū)編碼病毒的衣殼蛋白，整個(gè)核衣殼由60個(gè)P1區(qū)編碼多肽的四聚體（VP1－VP4）組成。前3個(gè)病毒衣殼蛋白（VP1－VP3）定位在病毒衣殼的外表面，而短的VP4則完全定位在病毒衣殼的內(nèi)表面。病毒衣殼蛋白通過與宿主細(xì)胞膜上的受體結(jié)合介導(dǎo)最初的感染。許多小RNA病毒有著類似的受體分子，它們屬于免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily，IgSF），IgSF的胞外區(qū)由2～5個(gè)帶有氨基末端的免疫球蛋白樣區(qū)組成。例如，柯薩奇病毒B1－B6受體（coxsackievirus－adenovirus receptor，CAR）有 2 個(gè)氨基末端區(qū)［1］。在這些受體中，氨基末端區(qū)即D1區(qū)與小RNA病毒上的“峽谷”的保守氨基酸結(jié)合，而觸發(fā)病毒的不穩(wěn)定和脫衣殼。因此，一個(gè)單一的受體足以使病毒入侵細(xì)胞，尤其對脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）和鼻病毒（rhinovirus，HRV）而言。然而，一些病毒可利用非IgSF細(xì)胞表面受體去結(jié)合“峽谷”的外表面。例如，某些HRV可利用低密度脂蛋白受體［2］，人類血小板糖蛋白配體－1和清道夫受體B2都是腸病毒71（enterovirus 71，EV71）的細(xì)胞受體［3］?？谔阋卟《究膳c整聯(lián)蛋白αvβ3或硫酸乙酰肝素結(jié)合，因細(xì)胞系和病毒毒株不同而各異。但這些相互作用不會(huì)引起病毒粒子的不穩(wěn)定和脫衣殼，而是可能導(dǎo)致其他受體的聚集或觸發(fā)隨后的胞吞。例如，柯薩奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）通過與第二級受體DAF（decay－accelerating factor，DAF）結(jié)合而募集CAR到病毒入侵位點(diǎn)，而DAF是一種在上皮細(xì)胞中表達(dá)的受體［4］。柯薩奇病毒A21只有輔助受體ICAM－1（intercellular adhesion molecule－1，ICAM－1）存在的情況下才能與DAF結(jié)合而入侵細(xì)胞。因此，受體識(shí)別在決定病毒對細(xì)胞的趨向性和宿主范圍方面至關(guān)重要。然而，宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白與病毒衣殼蛋白間的相互作用同樣很重要。例如，CVB3VP2可能特異地結(jié)合到凋亡前體蛋白Siva，影響細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)、病毒的擴(kuò)散和該病毒導(dǎo)致的病理學(xué)進(jìn)程?？膳cDAF結(jié)合的CVB3進(jìn)入極化的腸上皮細(xì)胞需要利用caveolin蛋白來完成內(nèi)吞作用。腸道病毒屬中的艾柯病毒7（Echovirus 7）通過clathrin蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用進(jìn)入感染細(xì)胞，接著病毒粒子先后被早期核內(nèi)體和晚期核內(nèi)體運(yùn)輸，直至基因組RNA被釋放。核內(nèi)體的成熟需要Rab5蛋白和Rab7蛋白的參與［5］。

2 病毒RNA復(fù)制時(shí)參與的病毒蛋白和宿主細(xì)胞蛋白

小RNA病毒的感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞膜的滲透性和膜結(jié)構(gòu)成分的改變，這些改變是病毒復(fù)制過程所必需。已經(jīng)證明，病毒復(fù)制復(fù)合物與病毒誘導(dǎo)的膜泡緊密相關(guān)，該復(fù)制復(fù)合物主要包括各種與復(fù)制相關(guān)的病毒蛋白和宿主細(xì)胞蛋白（見表1）。

表1 參與小RNA病毒RNA復(fù)制的細(xì)胞蛋白Tab.1 Cellular proteins involved in picornavirus RNA replication

2.1 2B蛋白和2BC蛋白 在感染的細(xì)胞中，病毒蛋白2B及其前體2BC影響著細(xì)胞膜的改變［6］。COPII蛋白在病毒誘導(dǎo)細(xì)胞生成囊泡產(chǎn)物中發(fā)揮作用。2B和2BC蛋白包含2個(gè)疏水區(qū)，該疏水區(qū)由α兩性分子α－螺旋功能域組成，這種功能域在多聚化，整合進(jìn)宿主細(xì)胞高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上起著重要作用，從而產(chǎn)生病毒誘導(dǎo)的囊泡，形成孔蛋白復(fù)合物［7］。2B或2BC蛋白在高爾基體上的累積改變了漿膜的滲透性，引起高爾基體復(fù)合物的降解，最終導(dǎo)致細(xì)胞的裂解。融合2B/2BC復(fù)合物的細(xì)胞器外膜增加了Ca2＋的流失，致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中的Ca2＋含量減少［8］。2B/2BC復(fù)合物導(dǎo)致的Ca2＋穩(wěn)態(tài)失衡是阻斷蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制之一［9］。2B誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)Ca2＋失衡同時(shí)與其抗細(xì)胞凋亡特性緊密相關(guān)。有報(bào)道稱甲型肝炎病毒2B蛋白可以通過阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子－3（Interferon Regulatory Factor 3，IRF－3）的活化來抑制細(xì)胞內(nèi)的干擾素－β基因的轉(zhuǎn)錄，這一機(jī)制被認(rèn)為對病毒的生存至關(guān)重要［10］。

2.2 3A蛋白、3AB蛋白和3B蛋白 3A蛋白為膜結(jié)合蛋白，在病毒感染過程中抑制細(xì)胞蛋白分泌和調(diào)節(jié)膜蛋白遞呈時(shí)發(fā)揮重要作用。CVB3 3A蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)可以擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高爾基體之間的正常物質(zhì)交換。此外，3A蛋白引起的蛋白運(yùn)輸?shù)奈蓙y，究其原因是Arf（ADP－ribosylation factor）家族蛋白的再分布。Arf家族蛋白是膜分泌途徑的重要成員［11］。Arf蛋白在有活性的GTP結(jié)合形式和無活性的GDP結(jié)合形式之間轉(zhuǎn)換的周期過程中受鳥嘌呤核苷轉(zhuǎn)換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）和 Arf GTP酶－活化蛋白（Arf GTPase－activating proteins，GAPs）調(diào)節(jié)［12］。真菌的代謝物——布雷菲爾得菌素（Brefeldin A，BFA）可通過抑制從Arf－GDP到Arf－GTP的再生來阻斷細(xì)胞中由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的蛋白運(yùn)輸。同時(shí)BFA可以抑制PV的復(fù)制，由此我們能夠推測出Arf蛋白參與了病毒RNA的復(fù)制。3A蛋白和3CD蛋白可分別通過不同的機(jī)制募集Arfs蛋白結(jié)合到膜表面［13］。表達(dá)的3A蛋白募集Arfs結(jié)合到膜上，其方式是通過特異地募集細(xì)胞GEF和高爾基體特異的BFA抗性因子1（Golgi－specific brefeldin A resistance factor 1，GBF1）而實(shí)現(xiàn)［14］。然而，表達(dá)的3CD蛋白可導(dǎo)致其他的GEFs，即BFA抑制鳥嘌呤核苷轉(zhuǎn)換因子1（Brefeldin A－inhibited guanine nucleotide－exchange protein 1，BIG1）和 BIG2結(jié)合到膜上［15］。PV、CVB3等許多種小RNA病毒3A蛋白利用高爾基體接頭蛋白acyl coenzyme A （acyl－CoA）binding domain protein 3（ACBD3/GPC60）來募集 Phosphatidylinositol 4－kinase class III beta（PI4KIIIβ）蛋白，從而參與小 RNA 病毒的復(fù)制［16］。

3AB蛋白是一個(gè)多功能蛋白。3A蛋白的疏水區(qū)與膜上的囊泡密切聯(lián)系。這種相互作用被認(rèn)為是錨定病毒復(fù)制復(fù)合體到病毒誘導(dǎo)生成的囊泡［17］。體外實(shí)驗(yàn)時(shí)，重組的3AB蛋白可以與PV 3D蛋白和3CD蛋白相互作用［18］。在PV基因組的四葉草狀RNA上，膜相關(guān)蛋白3AB能夠直接結(jié)合到聚合酶前體蛋白3CD上，從而激發(fā)3CD蛋白的蛋白酶活性，因此3AB蛋白可能在RNA復(fù)制復(fù)合物中作為3D聚合酶的錨定［19］。體外表達(dá)的3AB蛋白能夠刺激PV 3D聚合酶發(fā)揮活性。此外，已經(jīng)證明在VPg尿苷酰化過程中3AB蛋白作為3D聚合酶的底物而發(fā)揮作用。3AB蛋白可以摻入復(fù)制復(fù)合體使VPg尿苷?；V 3AB蛋白具有其他功能，如雙螺旋去穩(wěn)定作用。這表明3AB蛋白在使RNA二級結(jié)構(gòu)松散時(shí)具有核苷酸分子伴侶活性［20］。

腸病毒及HRV的3B（VPg）蛋白是一個(gè)小的多肽，含有21－23個(gè)氨基酸。小RNA病毒基因組的5′端通過存在于VPg上的保守酪氨酸中5′酪氨酰膽堿鍵能夠與VPg共價(jià)結(jié)合。研究證實(shí)VPg與PV 3D聚合酶有相互作用關(guān)系，3D聚合酶可以將UMP混合進(jìn)VPg蛋白生成 VPg－pU和VPg－pU－pU。這些產(chǎn)物在PV感染的細(xì)胞中及病毒復(fù)制復(fù)合體的粗提物中都能夠觀察到［21］。此時(shí)的VPg被用來作為合成正鏈和負(fù)鏈RNA的引物。

2.3 3CD蛋白和3D蛋白 3CD蛋白是成熟的3C蛋白酶和3D聚合酶的前體，具有蛋白酶活性卻沒有聚合酶活性［22］。3CD蛋白還參與PV P1前體蛋白的加工處理。PV 3CD蛋白在病毒RNA復(fù)制過程中發(fā)揮環(huán)化病毒基因組的作用，這一作用通過3CD蛋白與病毒RNA的5′端和3′端相互作用來完成［23］。參與病毒IRES啟動(dòng)的蛋白翻譯的PCBPs蛋白（poly（rC）binding proteins，PCBPs）和3CD蛋白是核糖核蛋白復(fù)合物中的重要組成成員，該復(fù)合物與PV基因組的5′端結(jié)合并形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)I（stem－loop I）。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PCBPs具有四種亞型（PCBP 1－4），但僅發(fā)現(xiàn)PCBP 1和PCBP 2參與腸病毒的復(fù)制［24］。PCBP 1和PCBP 2是KH結(jié)構(gòu)域RNA結(jié)合蛋白，該類RNA結(jié)合蛋白在正常細(xì)胞中參與細(xì)胞mRNA的代謝。PCBP2可同時(shí)結(jié)合到PV的IRES和stem－loop I，然而PCBP1只能與stem－loop I結(jié)合。另外一個(gè)細(xì)胞蛋白——異質(zhì)細(xì)胞核核糖核蛋白K（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K，hnRNP K）可以與EV71 5′－UTR的stem－loop I－II、stem－loop IV 相互作用。在感染EV71的細(xì)胞中，hnRNP K富集在病毒復(fù)制的場所——細(xì)胞質(zhì)中，與之相應(yīng)的是在未感染病毒的細(xì)胞中hnRNP K僅存在于細(xì)胞核。在hnRNP K表達(dá)量下調(diào)（siRNA抑制hnRNP K蛋白表達(dá)）的細(xì)胞中，病毒的產(chǎn)量顯著下降并且病毒RNA的合成也遲緩［25］。此外，3CD蛋白被證實(shí)也與hnRNP C蛋白相互作用［26］。在正常細(xì)胞中hnRNP C參與mRNA前體的加工處理。缺失蛋白與蛋白相互作用活性的hnRNP C突變體表現(xiàn)為抑制病毒正鏈RNA的合成，這一結(jié)果提示我們hnRNP C蛋白參與RNA的復(fù)制。3CD蛋白與PCBP，hnRNP C這些細(xì)胞蛋白以及病毒蛋白3AB相互作用并結(jié)合在PV RNA的stem－loop I結(jié)構(gòu)上形成一個(gè)病毒RNA復(fù)制復(fù)合物。已有報(bào)道證明其他數(shù)個(gè)細(xì)胞蛋白也與3CD蛋白相互作用。真核細(xì)胞的延伸因子EF－1α可與PV 3CD－stem－loop I復(fù)合物相互作用。轉(zhuǎn)錄因子OCT－1和核仁分子伴侶B23在HRV16感染時(shí)與3CD蛋白一同定位在細(xì)胞核。另外，成熟的重組3C蛋白可在體外降解OTC－1。從3CD前體蛋白中解離的成熟3C蛋白起到在細(xì)胞核中關(guān)閉宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性的重要作用。

病毒RNA依賴的RNA聚合酶3D蛋白是病毒RNA復(fù)制復(fù)合物的主要成分之一，從該復(fù)合物中純化的3D聚合酶具有RNA鏈延伸活性。3D聚合酶可使VPg尿苷化，并以VPg－pUpU為引物起始病毒RNA的復(fù)制［27］。PV聚合酶之間的相互作用已經(jīng)在生化研究和晶體結(jié)構(gòu)研究中被證實(shí)。聚合酶的寡聚化被認(rèn)為與模板的高效利用有關(guān)。利用酵母雙雜交系統(tǒng)成功鑒定了宿主蛋白Sam68與PV 3D蛋白之間存在相互作用，該相互作用也在PV感染的細(xì)胞中觀察到。Sam68是一種RNA結(jié)合蛋白，它在細(xì)胞中介導(dǎo)著可變剪接作為對胞外信號的反應(yīng)，但是Sam68在病毒RNA復(fù)制中的詳細(xì)功能仍需繼續(xù)研究。

3 結(jié) 語

小RNA病毒利用多種蛋白與基因組RNA相互作用來調(diào)節(jié)自身生存與繁殖。近年來，宿主細(xì)胞因子參與病毒生命活動(dòng)的相關(guān)探索成為了研究熱點(diǎn)，闡明病毒和宿主間的相互作用對于理解病毒的復(fù)制、毒力和致病性至關(guān)重要。然而，不同組織細(xì)胞對病毒的敏感性不同，其中的感染機(jī)制仍需要深入研究。另外，細(xì)胞內(nèi)存在的眾多microRNAs是否具有降解小RNA病毒的能力仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。理解宿主細(xì)胞蛋白是如何與病毒蛋白、RNA相互作用，將為基于它們相互作用設(shè)計(jì)抗病毒新藥提供理論基礎(chǔ)。

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