膽型螺桿菌的分離及鑒定

H.bilis是1995年Fox JG等從小鼠的結(jié)腸中分離出的新型腸肝螺桿菌屬［1］。H.bilis主要定植在小鼠的肝膽系統(tǒng)，也可下行至小鼠的結(jié)腸。研究表明，H.bilis感染與膽石癥及膽囊癌的發(fā)生相關(guān)。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中國(guó)的流行病學(xué)特征尚不明確，本課題組成功分離H.bilis，為進(jìn)一步研究其致病性及制備相應(yīng)高特異性抗體檢測(cè)國(guó)人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染情況奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物來(lái)源 無(wú)特殊病原體（Specific pathogen free，SPF）的BALB/c小鼠，6～8周齡，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.1.2 細(xì)菌培養(yǎng)基 空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)（購(gòu)于上海腹瀉病防治中心），脫纖維羊血，抗生素（萬(wàn)古霉素，多粘菌素B，二性霉素B，TMP）。

1.1.3 細(xì)菌生化鑒定試劑 由廣東環(huán)凱微生物公司提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理 取健康BALB/c小鼠處死后，留取腸組織，布氏肉湯保種液－80℃保存。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng) 組織勻漿后均勻涂布于空腸彎曲菌選擇性瓊脂基礎(chǔ)，添加5%～10%凍融脫纖維羊血，及選擇性抗生素萬(wàn)古霉素10mg/L、多粘菌素B 2 500U/L、二性霉素B 10mg/L，TMP 5mg/L，微需氧條件下 （如5%O2、10%的CO2及85%的N2）37℃培養(yǎng)5～7d，挑選可疑菌落傳代培養(yǎng)。

1.2.3 形態(tài)鑒定 可疑細(xì)菌涂片革蘭染色，油鏡下觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.4 生化鑒定 可疑細(xì)菌行快速尿素酶、氧化酶、過(guò)氧化物酶及硝酸還原酶實(shí)驗(yàn)（檢測(cè)試劑盒由環(huán)凱生化公司提供），具體參見(jiàn)操作說(shuō)明。

1.2.5 掃描電鏡 PBS緩沖液反復(fù)離心洗凈細(xì)菌后，用戊二醛懸浮固定12～16h，PBS調(diào)整濃度至108cfu/mL，取10μL菌液滴加至干凈固相支持物（載玻片）乙醇逐級(jí)脫水，干燥后金屬鍍膜觀(guān)察。

1.2.6 16SrRNA及23SrRNA基因測(cè)序 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA。以可疑菌基因組DNA為模板，分別采用螺桿菌屬特異性 引 物 B38 5′－CTATGACGGGTATCCGGC－3′B39 5′－CTCACGACACGAGCTGAC－3′。

根據(jù)已知基因序列的23SrRNA基因的同源性比較及23SrRNA基因的保守序列分布，設(shè)計(jì)并選取四對(duì)擴(kuò)增23SrRNA基因的通用引物：Primer 1.5－ATTTCCGAATGGGGCAAC －3，3－CTTGTTCGCTATCGGTGTGA －5；Primer 2.5－TCACACCGATAGCGAACAAG －3，3－TCAACTTGGCCATGGATAGA －5；Primer 3.5－TCTATCCATGGCCAAGTTGA －3，3－CCCGACTAACCCTACGATGA －5；Primer 4.5－CGTAGGGTTAGTCGGGTCCT －3，3－TCTCATCTACCTGTGTCGGTTT－5，行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94℃10 min總變性，94℃30s，54℃30s，72℃55s，共35個(gè)循環(huán)，72℃10min總延伸。擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳條件80V，30min。陽(yáng)性結(jié)果測(cè)序分析（測(cè)序工作由英俊生物公司完成）。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài) 5～7d后空腸彎曲菌血平板上可見(jiàn)針尖樣0.1～1mm左右的透明或半透明濕潤(rùn)霧狀菌落。

2.2 生化鑒定 該菌尿素酶，氧化酶及過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，硝酸還原試驗(yàn)陰性，42℃不能生長(zhǎng)，1.5%氯化鈉，1% 甘氨酸可生長(zhǎng)，能水解醋酸吲哚酚，不能水解馬尿酸鹽。而對(duì)照的H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株ATCC11637，尿素酶，氧化酶及過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，硝酸還原試驗(yàn)陽(yáng)性，1% 甘氨酸不能生長(zhǎng)。

2.3 光鏡觀(guān)察 涂片革蘭染色陰性，油鏡觀(guān)察示不規(guī)則的“S”，“C”型細(xì)小形態(tài)，與H.pylori鏡下相似。但菌體更細(xì)長(zhǎng)，螺旋也較多。（如圖1）

2.4 掃描電鏡 10 000倍放大，見(jiàn)細(xì)菌長(zhǎng)1.5～5.0mm，寬0.2～0.3mm，形態(tài)似不規(guī)則的“S”，“W”，“C”，兩極稍尖，菌體兩極有單根鞭毛。（如圖2）

圖1 H.bilis革蘭染色陰性Fig.1 H.bilis Gram’s negative stain

圖2 H.bilis掃描電鏡圖片F(xiàn)ig.2 Scanning electron micrograph of H.bilis

圖3 螺桿菌屬特異性引物PCR擴(kuò)增螺桿菌16SrRNA基因Fig.3 PCR amplification of Helicobacter spp.gene

2.5 16srRNA基因測(cè)序 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，于780bp見(jiàn)明顯陽(yáng)性條帶（圖3），產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中基因組同源性對(duì)比，結(jié)果與Helicobacter bilisATCC43879同源性達(dá)到99%（圖4）。

2.6 23srRNA基因測(cè)序 同樣，分4段：366bp、443bp、664和305，除了重復(fù)的，共1 717bp，結(jié)果與Helicobacter bilisATCC43879同源性達(dá)到99%。證實(shí)本實(shí)驗(yàn)所分離的細(xì)菌即為膽型螺桿菌（圖5）。

圖4 膽型螺桿菌16srRNA基因的一段測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing of 16srRNA gene of H.bilis

3 討 論

近年來(lái)越來(lái)越多的螺桿菌屬其他成員不斷被分離發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的螺桿菌都能夠定植在胃腸道，根據(jù)它們的寄居主要部位不同，還將螺桿菌分為兩大亞類(lèi)：胃內(nèi)螺桿菌及肝腸螺桿菌（enterohepaticHelicobacterspecies，EHS）。

H.bilis主要定植在小鼠的肝膽系統(tǒng)，也可下行至小鼠的結(jié)腸。研究表明，H.bilis感染與膽石癥及膽囊癌的發(fā)生相關(guān)。眾所周知，膽石癥患者膽囊癌的發(fā)病率是非膽石癥者的2.4～10倍，但即使在膽石癥患者中，也只有少部分人發(fā)生膽囊癌，可見(jiàn)除了膽石癥外，還有其他協(xié)同因素共同促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生，這些因素包括遺傳因素、地理和環(huán)境因素等。于泰國(guó)和日本進(jìn)行的研究采用PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊癌和肝膽系統(tǒng)良性病變患者的組織感染該菌的情況，結(jié)果顯示膽囊癌患者感染率明顯高于膽囊良性病變患者［2］。Satoru Takayama等人進(jìn)一步研究其致癌機(jī)制，將H.bilis與膽囊癌細(xì)胞株HuCCT－1共同孵育一定時(shí)間后，采用雙熒光素梅報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè) NF－KB，E2轉(zhuǎn)錄因子（E2transcription factor，E2F）及環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件（cyclic AMP response element，CRE）的活性，同時(shí)檢測(cè)培養(yǎng)上清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的濃度，結(jié)果顯示NF－KB，E2F及CRE的活性較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，培養(yǎng)上清中的VEGF濃度也較對(duì)照組升高。說(shuō)明H.bilis可能通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子如NF－KB，促進(jìn)VEGF的分泌而促進(jìn)血管發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生成［3］。

H.bilis感染人或動(dòng)物能引起慢性活動(dòng)性肝炎，結(jié)腸炎，甚至腫瘤形成。在存在胰膽管合流異常的患者中，由于反流的存在，H.bilis的感染比正常人出現(xiàn)更早，最早可嬰兒期就出現(xiàn)，大大增加了患者膽系腫瘤發(fā)生的危險(xiǎn)性［4］。有研究顯示，H.bilis可打破免疫平衡，激活炎癥細(xì)胞，增加宿主對(duì)外源性感染的敏感性［5］，在潰瘍性結(jié)腸炎的患者中，螺桿菌屬的檢出率都非常高，且PCR測(cè)序結(jié)果與H.bilis的符合率為100%［6］。慢性肝病的患者，除了自身免疫性肝炎以外，H.bilis的抗體水平都較正常人 顯著升高［7］。H.bilis和其他螺桿菌屬之間有一定的抗原交叉反應(yīng)，這對(duì)H.bilis的診斷造成一定的困擾，尋找特異性的H.bilis抗原有助于對(duì)H.bilis感染的病因?qū)W診斷［8］。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于H.bilis的研究甚少，其致病性及在中國(guó)的流行病學(xué)特征尚不明確，本課題組成功分離H.bilis，為進(jìn)一步研究其致病性及制備相應(yīng)高特異性抗體檢測(cè)國(guó)人及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染情況奠定了基礎(chǔ)。

圖5 膽型螺桿菌23srRNA基因的一段測(cè)序結(jié)果Fig.5 Sequencing of 23srRNA gene of H.bilis

［1］Fox JG，Dewhirst FE，Tully JG.Helicobacter hepaticussp.nov.，a microaerophilic bacterium isolated from livers and intestinal mucosal scrapings from mice［J］.J Clin Microbiol，1994，32（5）：1238－1245.

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