腺相關(guān)病毒的衣殼裝配和DNA衣殼化機(jī)制

王啟釗，呂穎慧，李招發(fā)，刁勇，許瑞安

1 華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所，泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

腺相關(guān)病毒的衣殼裝配和DNA衣殼化機(jī)制

王啟釗1,2，呂穎慧1,2，李招發(fā)1,2，刁勇1,2，許瑞安1,2

1 華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所，泉州 362021

2 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

重組腺相關(guān)病毒載體 (rAAV) 是基因治療臨床應(yīng)用載體的選擇之一。在簡(jiǎn)述野生型AAV基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制機(jī)制的基礎(chǔ)上，闡述了AAV包裝過(guò)程中兩個(gè)主要事件：衣殼蛋白的裝配和基因組DNA的衣殼化。雖然對(duì)AAV的包裝機(jī)制總體上已有一定的認(rèn)識(shí)，但其詳細(xì)的分子機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系仍需完善和充實(shí)。AAV病毒本身相關(guān)機(jī)制的深入研究有助于改善rAAV載體的制備技術(shù)，促進(jìn)rAAV基因藥物研發(fā)。

腺相關(guān)病毒，裝配，衣殼化，基因治療

Abstract:Recombinant adeno-associated viral vectors (rAAV) have been widely used as gene therapy vectors in clinical trials.Here, we reviewed the genomic structures and replication mechanisms of wt-AAV. Then, the assembly of capsid and the encapsidation of genomic DNA, two major events during AAV pakaging, was discussed in detail. Although the overall pattern of virus assembly and encapsidation is known, the molecular mechanisms and the structure-function relationship involved in these processes are not well understood. Further elucidatation of these processes may improve the production technology of rAAV and develop gene drug based on rAAV.

Keywords:adeno-assoicated virus, assembly, encapsidation, gene therapy

腺相關(guān)病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 為 細(xì)小病毒家族成員，因其為復(fù)制缺陷型病毒、基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、與寄主染色體定點(diǎn)整合，且迄今未發(fā)現(xiàn)與任何人類(lèi)疾病相關(guān)，被認(rèn)為是介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的理想載體。此外，AAV還具有免疫原性弱、宿主范圍廣、理化性質(zhì)穩(wěn)定、長(zhǎng)期表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)[1]。在上世紀(jì)80年代重組AAV (rAAV) 載體制備方法取得進(jìn)展之后，研究人員開(kāi)始逐步將其應(yīng)用于臨床治療研究，并證明了該載體的有效性 (http://www.abedia.com/wiley/)。然而，隨著臨床研究的深入，rAAV載體存在的一些問(wèn)題逐漸暴露，如細(xì)胞毒性、免疫原性、整合帶來(lái)的安全性、包裝容量限制、產(chǎn)業(yè)化制備技術(shù)等[2]。理想和現(xiàn)實(shí)的差距促使科研人員開(kāi)始重新將目光聚集于 AAV病毒本身的一些特性，以期從源頭上尋找解決問(wèn)題的答案。本文在簡(jiǎn)述野生型AAV基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)制機(jī)制的基礎(chǔ)上，闡述了AAV包裝過(guò)程中兩個(gè)主要事件：衣殼蛋白的裝配和基因組DNA的衣殼化。

1 AAV基因組結(jié)構(gòu)與復(fù)制機(jī)理

1.1 AAV的基因組結(jié)構(gòu)

了解AAV的基因組結(jié)構(gòu)是闡明AAV復(fù)制機(jī)理與包裝機(jī)制的基礎(chǔ)。目前大多數(shù)基因治療用 rAAV以AAV2基因組為骨架 (圖1)。AAV2基因組為4 679個(gè)核苷酸的單鏈DNA (ssDNA)，兩末端為倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列 (Inverted terminal repeat，ITR)，是AAV整合、復(fù)制、拯救和包裝所必須的順式作用元件，并具有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的活性。ITR序列之間為病毒編碼區(qū)，含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框架，目前認(rèn)為可表達(dá) 4個(gè) Rep蛋白、3個(gè)Cap蛋白及一個(gè)AAP蛋白。

AAV2 DNA兩端的ITR由145個(gè)核苷酸組成，在ITR二級(jí)結(jié)構(gòu)中，由3段回文結(jié)構(gòu)組成T型空間結(jié)構(gòu)。B-B'和C-C'構(gòu)成T的頂端，A-A'構(gòu)成T的長(zhǎng)臂。ITR上有2個(gè)Rep蛋白結(jié)合位點(diǎn)，分別為RBE和RBE’，AAV Rep78和Rep68蛋白能結(jié)合其上。另外，ITR上還有一個(gè)末端斷裂位點(diǎn) (Terminal resolution site，Trs) 和一個(gè)D序列，它們?cè)贒NA的復(fù)制過(guò)程中具有非常重要的作用[3]。

AAV2 Rep基因編碼至少 4種非結(jié)構(gòu)蛋白：Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。由p5啟動(dòng)子起始的2種mRNA翻譯成Rep78和Rep68；p19啟動(dòng)子起始的2種mRNA翻譯成Rep52和Rep40。Rep52和Rep40蛋白C末端的氨基酸序列分別與Rep78和Rep68相同 (圖1)。Rep78和Rep68蛋白與AAV基因表達(dá)的正負(fù)調(diào)控有關(guān)。這兩種蛋白都可與ITR中的RBE結(jié)合。Rep78/Rep68具有ATP酶和螺旋酶的功能。當(dāng)其與ITR結(jié)合時(shí)又能在Trs處切割基因組DNA，使其產(chǎn)生缺口。這兩種蛋白對(duì)于AAV生活周期的每一時(shí)期都是必需的。Rep52和 Rep40參與了病毒的裝配，它們?cè)诓《倦p鏈DNA(dsDNA) 合成中是不需要的，但在ssDNA和病毒顆粒的累積中則是必需的[4]。

一直以來(lái)，Cap基因被認(rèn)為只編碼衣殼蛋白，其轉(zhuǎn)錄從p40啟動(dòng)子開(kāi)始，形成約2.6 kb 和2.3 kb mRNA，拼接后分別編碼 3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白 VP1、VP2和VP3，分子量分別為87、73、61 kDa，在成熟病毒顆粒中的比例大約為 1∶1∶8。VPs蛋白的 C末端具有相同的氨基酸序列，VP2的N端比VP 3多65個(gè)氨基酸，而VP1的N端比VP2還要多137個(gè)氨基酸。VP2和VP3由2.3 kb的mRNA翻譯而來(lái)，而 VP1則由 2.6 kb的 mRNA翻譯。VP1、VP2和VP3的起始密碼子分別為 AUG(2203)、ACG(2614)和AUG(2809)，其中ACG(2614) 是一個(gè)真核細(xì)胞特有的起始密碼子，它的啟動(dòng)能力低于AUG。如果將Cap基因中的ACG(2614) 突變成AUG(2614)，可提高VP2表達(dá)，但會(huì)降低VP3表達(dá)[5]。VP1 N末端的PLA2活性在 AAV感染過(guò)程中起到關(guān)鍵作用[6]，而VP3對(duì)于AAV組裝是必需的[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)，Cap基因還編碼另外一個(gè)蛋白，稱(chēng)為裝配激活蛋白(Assembly-activating protein，AAP)。AAP 是由 2.3 kb mRNA上的ACG(2729) 密碼子起始翻譯，蛋白大小為23 kDa[8]。AAP主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，AAP不但能幫助VPs進(jìn)入細(xì)胞核，并可能為VPs裝配提供支架，或協(xié)助VPs進(jìn)行正確折疊。

圖1 AAV基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Genomic structure of AAV.

1.2 AAV DNA復(fù)制機(jī)理

AAV復(fù)制時(shí)，以自身3′端的序列作為引物，產(chǎn)生兩個(gè)等長(zhǎng)的分子 (母鏈/子鏈)，兩者具有一個(gè)共價(jià)連接的末端。之后，Rep78和 Rep68發(fā)揮核酸內(nèi)切酶的作用，在母鏈Trs位點(diǎn)產(chǎn)生一個(gè)缺口。在T型結(jié)構(gòu)頂端的RBE’，能維持這一結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。新產(chǎn)生的-3′OH可以作為DNA聚合酶的底物，合成新的ITR序列。最后，ITR退火形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并將-3′OH重新置于單鏈取代合成的起始位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)新一輪的復(fù)制，可以形成一個(gè)新的 AAV病毒以及一個(gè)母鏈/子鏈共存的二聚體。如果其中一個(gè)ITR中的缺口產(chǎn)生失敗，那么產(chǎn)生的AAV病毒將可以二聚體的形式穩(wěn)定存在，這是構(gòu)建帶有雙鏈基因組的自身互補(bǔ)型AAV載體的基礎(chǔ)[3]。

除了本身基因外，AAV還需借助其他基因完成生命周期，提供基因有腺病毒 (Ad) 和單純皰疹病毒(HSV)。以 Ad為例，E1a蛋白可激活 Ad早期基因及AAV Rep和Cap基因，并誘導(dǎo)寄主細(xì)胞進(jìn)入S期；E1b和E4orf6的作用是形成復(fù)合物，參與AAV基因組由單鏈到雙鏈的轉(zhuǎn)變以及 AAV mRNA從核內(nèi)運(yùn)送到核外的過(guò)程；E2a是一種單鏈DNA結(jié)合蛋白，可以加速AAV DNA的合成過(guò)程。AVI RNA的作用則是降低干擾素效應(yīng)對(duì)寄主細(xì)胞翻譯的影響[4]。

2 AAV包裝機(jī)制

雖然AAV的結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，人們對(duì)其復(fù)制機(jī)理也已有一定程度了解，但是目前對(duì)于AAV衣殼的裝配過(guò)程以及基因組進(jìn)入衣殼的過(guò)程還知之甚少?，F(xiàn)有的 AAV包裝機(jī)制模型在以下幾個(gè)方面達(dá)成了基本共識(shí)。第一，ssDNA通過(guò)某種機(jī)制導(dǎo)入到已經(jīng)形式的病毒衣殼內(nèi)；第二，Rep蛋白連接ssDNA的ITR以及Cap蛋白，將ssDNA定位于衣殼表面；第三，ssDNA的移動(dòng)需要Rep蛋白的螺旋酶活性和ATPase活性；第四，ssDNA進(jìn)入衣殼的方向是3′?5′；第五，在衣殼五倍軸的頂端有一小孔是ssDNA進(jìn)入衣殼的口袋[9]。

2.1 AAV衣殼的超級(jí)結(jié)構(gòu)

對(duì)AAV衣殼結(jié)構(gòu)的研究是深入了解AAV包裝機(jī)制的基礎(chǔ)。AAV顆粒直徑在 20~26 nm之間 (圖2)，衣殼由60個(gè)衣殼蛋白亞單位構(gòu)成，排列成T=1的二十面體結(jié)構(gòu) (二十面體是由20個(gè)三角形圍成的凸多面體，每 5個(gè)三角形圍出一個(gè)五倍頂，通過(guò)每一對(duì)相對(duì)著的五倍頂有一個(gè)五倍旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)軸。通過(guò)每一對(duì)相對(duì)著的三角形中心有1個(gè)三倍旋轉(zhuǎn)軸；通過(guò)每一對(duì)相對(duì)著的棱的中點(diǎn)有1個(gè)二倍旋轉(zhuǎn)軸)。二十面體的每個(gè)面由 3個(gè)衣殼蛋白分子組成 (可以全部為VP3，也可以有VP1、VP2、VP3共同構(gòu)成)。三倍軸具有最多凹陷的表面區(qū)域，并且具有最高的表面接觸能量，是衣殼蛋白相互交叉最多的地方，從三倍軸往下看，最大的特征是有 3個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起——稱(chēng)為三倍突起，圍繞在三倍軸周?chē)鶾11]。AAV衣殼中具有一個(gè)高度保守的核心亞單位，即由 8股折疊鏈 (A-H) 構(gòu)成的 β 桶 (Eight-stranded β-barrel)，β桶主要位于衣殼的內(nèi)部。在 β折疊間存在 4個(gè)環(huán)(BC，EF，GH，HI，根據(jù)環(huán)所處的位置命名)，約占核心亞單位序列的60%左右，這些環(huán)突起到衣殼的表面，其中GH環(huán)又可以分為3個(gè)亞環(huán)，一個(gè)衣殼蛋白分子上的一個(gè)GH亞環(huán)和與其相鄰的2個(gè)衣殼蛋白分子中的各一個(gè)亞環(huán)共同形成 AAV衣殼的三倍突起，3個(gè)蛋白分子即形成3個(gè)突起[11](圖2A)。三倍突起的主要作用是識(shí)別受體，其上有硫酸乙酰肝素蛋白聚糖 (HSPG) 和整合素α5β1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12-14]。在2個(gè)三倍突起之間為二倍軸，二重軸具有最弱的氨基酸相互作用以及最低的表面接觸能量[11]。五重軸的表面接觸能量介于二重軸和三重軸之間，從每個(gè)五重頂位置有一個(gè)小孔，聯(lián)通病毒衣殼的內(nèi)部和外部，小孔外小內(nèi)大[15-16]。這個(gè)小孔在 DNA衣殼化中具有非常重要的作用，是 AAV DNA進(jìn)入衣殼的地方，它參與Rep蛋白結(jié)合、衣殼蛋白裝配、VP1 N末端暴露、AAV病毒感染等多個(gè)過(guò)程[6]。

圖2 AAV衣殼以及五倍軸小孔的結(jié)構(gòu)Fig. 2 Structures of AAV2 capsids and the pores at fivefold symmetry axes. (A) Surface topology of the AAV2 capsid. The arrows indicate the locations of the two-, three-, and five-fold axes. (B) An arrow indicates the HI loop on an AAV2 pentamer.(C, D) Backbone models of structures of fivefold symmetryrelated VPs shown as a side view (D) and from the outside (C)of the capsid[10].

2.2 AAV衣殼蛋白裝配

衣殼的裝配只需要Cap基因表達(dá)就能完成[17]。衣殼蛋白的表面全部由 VP3亞單位組成，VP1和VP2的N末端位于衣殼的內(nèi)部。那么，單獨(dú)的VP3能形成完整的衣殼嗎？

利用純化的 VP蛋白在細(xì)胞外研究表明，單獨(dú)的 VP1、VP2、VP3或 VP1、VP2、VP3混合，都能從單體聚集成寡聚體，寡聚體既可以是同源的，也可以是異源的，但是并不能形成完整的病毒樣顆粒[18]。如果在VP1、VP2、VP3混合物中加入 Hela細(xì)胞提取液，則能形成病毒樣顆粒，但形成的效率非常低。這一實(shí)驗(yàn)證明，AAV病毒樣顆粒的形成依賴(lài)于Hela細(xì)胞中的某些成分，同時(shí)也證明AAV的胞外重建不能僅僅通過(guò)VPs的自組裝來(lái)完成。

利用質(zhì)粒系統(tǒng)在Hela細(xì)胞中表達(dá)VP 蛋白的研究表明，VP3單獨(dú)表達(dá)時(shí)可在整個(gè)細(xì)胞中檢測(cè)到VP3，且在部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到由 VP3形成的小顆粒，而單獨(dú)表達(dá)VP1或VP2都能在核內(nèi)檢測(cè)到想要的VP蛋白表達(dá)，并可見(jiàn)病毒樣顆粒形成[19]。如果將VP3與VP1或VP2共表達(dá)，則在細(xì)胞質(zhì)中的VP3降低而在核內(nèi)積累。

利用桿狀病毒載體在昆蟲(chóng)細(xì)胞系Sf9表達(dá)VP的研究表明，VP3或 VP1單獨(dú)或共表達(dá)都不能形成病毒樣顆粒；VP2、VP1/VP2、VP2/VP3，VP1/VP2/VP3共表達(dá)都能形成病毒樣顆粒[19]。在桿狀病毒體系里面，VP2似乎是衣殼蛋白裝配成病毒樣顆粒的關(guān)鍵，盡管VP2能單獨(dú)形成病毒顆粒的實(shí)驗(yàn)中并沒(méi)有完全排除VP3。然而，帶有SV40 T抗原片段的VP3能單獨(dú)組裝成病毒樣顆粒，無(wú)需VP2的參與[20]。VP2和SV40 T都具有核定位信號(hào) (166PARKRLNF173)，可能起到運(yùn)送VP3進(jìn)入細(xì)胞核的作用

隨后，Warrington等在293細(xì)胞的研究表明中，VP3單獨(dú)表達(dá)就能產(chǎn)生病毒樣顆粒[7]。在Hela細(xì)胞中，VP3單獨(dú)表達(dá)的時(shí)候也不僅僅是在細(xì)胞質(zhì)中可以檢測(cè)到VP3[19]。那么，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，VP3又是如何進(jìn)入細(xì)胞核的呢？最近有關(guān) AAP的研究也許能為這一現(xiàn)象提供部分解釋[8]。AAP主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，可能協(xié)助VP蛋白從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核。

2.3 影響AAV衣殼裝配的結(jié)構(gòu)區(qū)域

AAV衣殼5倍軸上的小孔對(duì)AAV的衣殼的裝配具有一定的影響。小孔由5個(gè)VP3蛋白分子像照相機(jī)快門(mén)一樣圍繞而成。小孔外面部分成圓柱狀，內(nèi)部則成漏斗狀[10]。圓柱狀結(jié)構(gòu)從衣殼表面突起，由每個(gè)衣殼蛋白上的反向平行的β帶 (β-ribbon) 組成 (VP1位置上的322~338氨基酸)，這些氨基酸在靠近338這一段保守性較高，而另一端變化較大。漏斗狀部分由217~223氨基酸組成，并且在各個(gè)亞型之間高度保守[10]。在221氨基酸后面插入兩個(gè)酪氨酸殘基可以完全抑制蛋白裝配，而將322上的谷氨酸替換成丙氨酸 (E322A)，則能降低衣殼的包裝效率[10]。

圍繞在圓柱狀結(jié)構(gòu)周?chē)氖荋I環(huán) (位于βH和βI之間，653~659)，這上面的側(cè)鏈基團(tuán)可以與其他衣殼蛋白分子上的BC環(huán)和EF環(huán)上的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)[9,11]。HI環(huán)的長(zhǎng)度可能與衣殼蛋白的正確裝配有關(guān)。如果將AAV5上的HI環(huán)替換到AAV2的相應(yīng)區(qū)域，衣殼就無(wú)法完成裝配，AAV5上的 HI環(huán)比AAV2少一個(gè)氨基酸。

另外，VP3的C末端、N末端都可能存在影響衣殼裝配的元件[21,7]，其具體的氨基酸定位與裝配之間的關(guān)系需要進(jìn)一步研究。

2.4 AAV衣殼的裝配地點(diǎn)

雖然目前對(duì)于 AAV完整衣殼產(chǎn)生之前的步驟了解還比較少，但是從其他病毒的研究我們可以總結(jié)出一定的規(guī)律。病毒衣殼的裝配一般包括以下幾個(gè)過(guò)程：第一，形成包裝的基本單位 (五聚體)；第二，5個(gè)五聚體圍繞一個(gè)五聚體進(jìn)行裝配形成裝配前體；第三，其他裝配單位組裝到第二步形成的裝配前體上[4]。

在感染初期，衣殼蛋白可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累并形成具有不同蛋白分子組成的寡聚體 (VP1∶VP2∶VP3比例不等)。雖然并不能完全排除在細(xì)胞質(zhì)中合成完整衣殼蛋白的可能性，但是從具有完整衣殼蛋白的特征峰60S的變化趨勢(shì)來(lái)看，衣殼的最終形成應(yīng)該在細(xì)胞核內(nèi)[22]。前面已經(jīng)講到，VP1和VP2 (無(wú)論是單體還是寡聚體) 主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，而單體的VP3在核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均勻分布，表明，VP1、VP2和 VP3在裝配過(guò)程中具有不同的結(jié)構(gòu)和行為。VP1和VP2上都具有核定位信號(hào) (166PARKRLNF173)，可能起到運(yùn)送 VP3進(jìn)入細(xì)胞核的作用[20]。然而，Grieger等對(duì)VPs上可能是核定位信號(hào)的堿性氨基酸區(qū)域 (Basic region，BR) 進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，VP1上有4個(gè)BR (BR1-4)，其中3個(gè) (BR2-4) 與VP2相同，而VP3只有BR4[23]。BR4 (307RPKRLN312) 對(duì)于病毒裝配是必需的，被認(rèn)為在病毒進(jìn)入細(xì)胞核過(guò)程中發(fā)揮作用的 BR3 (166PARKRLNF173) 對(duì)于維持病毒的感染活性是必需的，而 BR1 (120QAKKRVL126) 和BR2 (140PGKKRPV146) 對(duì)病毒感染也有一定的作用。BR3被認(rèn)為不是衣殼蛋白進(jìn)入細(xì)胞所必需的，除了作為核定位信號(hào)之外，BR3還參與AAV基因組的包裝過(guò)程。VP1和VP3上各有一個(gè)BR3存在，但是BR3似乎有些富余，因?yàn)橹灰幸粋€(gè)BR3存在就能保持AAV的感染和裝配特性。

即使在細(xì)胞核內(nèi)，也可檢測(cè)到 VP蛋白單體，因此無(wú)論是在核內(nèi)還是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，都可能存在一個(gè)衣殼蛋白聚合和解聚的平衡。與此相一致的是，AAV在進(jìn)入細(xì)胞后，是在細(xì)胞質(zhì)還是在細(xì)胞核完成脫殼一直都存在爭(zhēng)論。AAV感染后完整的衣殼蛋白最初在核仁中發(fā)現(xiàn)，隨后遍及整個(gè)細(xì)胞核，表明核仁的某些成分在衣殼蛋白裝配過(guò)程中起到重要作用[24]。然而，AAV VPs 在細(xì)胞內(nèi)究竟是如何形成完整衣殼的，還需要更多的研究[25]。

2.5 ssDNA進(jìn)入衣殼的方式

病毒基因組進(jìn)入病毒的兩種方式如下：1) 基因組與結(jié)構(gòu)蛋白相連；2) 病毒基因組通過(guò)某種機(jī)制導(dǎo)入到已經(jīng)形成的病毒顆粒。第一種方式在具有雙鏈基因組的病毒中較為常見(jiàn)，如HSV。目前普遍接受的有關(guān) AAV病毒顆粒的形成理論認(rèn)為，衣殼蛋白先組裝成完整的空病毒顆粒，然后單鏈基因組通過(guò)某種機(jī)制導(dǎo)入到衣殼內(nèi)部。多種 ssDNA和單鏈RNA (ssRNA) 病毒都是采用這一方式，如ΦX174、Φ6和小核糖核酸病毒。衣殼蛋白的組裝過(guò)程比較迅速，但是 dsDNA進(jìn)入衣殼的過(guò)程卻相對(duì)緩慢。目前，我們還不知道為什么 AAV基因組的衣殼化(Encapsidation) 會(huì)成為限速步驟。

成熟的病毒顆粒中，有的裝有 (+)ssDNA，有的裝有 (-)ssDNA，這些 DNA 都有類(lèi)似的 3′ITR 和5′ITR，到底是哪一端首先進(jìn)入衣殼呢？King等利用DNase酶切實(shí)驗(yàn)表明，DNA的衣殼化從3’ITR開(kāi)始，依照3′?5′的方向持續(xù)進(jìn)行[26]。如果 AAV基因組的長(zhǎng)度超過(guò)一定限度 (~5.2 kb)，那么包裝入病毒的DNA有很大一部分缺少5′端[27]。

2.6 AAV的包裝容量

AAV2的基因組大小為4.7 kb，一般認(rèn)為，AAV衣殼可以包裝相當(dāng)于本身基因組105%的DNA。然而，最近有報(bào)道稱(chēng)AAV5可以包裝~9 kb的DNA[28]。在這一文章發(fā)表之后，多個(gè)研究小組進(jìn)行了類(lèi)似研究[27,29-30]，其結(jié)果卻不盡相同，后三者認(rèn)為無(wú)論是哪個(gè)亞型的AAV，都不能有效包裝大于其本身基因組許多的DNA。Hirsch等這些相互沖突的研究結(jié)果分析之后表明，AAV作為載體之所以能表達(dá)~9 kb的基因可能是因?yàn)?AAV基因組片段在體內(nèi)重組而產(chǎn)生的結(jié)果[31]。以上實(shí)驗(yàn)再次證明，AAV衣殼的相對(duì)剛性只能容納一定大小的DNA。

2.7 ssDNA進(jìn)入衣殼的作用機(jī)制

負(fù)責(zé)DNA入殼的蛋白主要是Rep52和Rep40，當(dāng)然也不能排除其他蛋白參與的可能性。Rep52的螺旋酶活性嚴(yán)格依賴(lài)于自由的3′端，而Rep40還可以解開(kāi)平末端雙鏈DNA。是否Rep52和Rep40同時(shí)參與了AAV ssDNA的入殼，還是只有其中一個(gè)發(fā)揮作用還有待于進(jìn)一步研究。

King等提出了Rep52/40參與ssDNA入殼的3種模式[26]：第一，Rep52/40通過(guò)解螺旋作用打開(kāi)3′ITR的回文結(jié)構(gòu)，并依靠這一活動(dòng)提供的能量推動(dòng)3′ITR入殼。這一方式能比較好地解釋3′ITR入殼的機(jī)制，但是不能解釋后續(xù)的ssDNA如何入殼。第二，Rep52/40推動(dòng)處于雙鏈形式的 AAV基因組解鏈，一邊解鏈一邊將解鏈出來(lái)的ssDNA推入殼內(nèi)。第三，3′ITR的回文結(jié)構(gòu)并不直接參與DNA入殼，而是在Rep52/40推動(dòng) ssDNA入殼的同時(shí)進(jìn)行新一輪的復(fù)制。這一方式將可能導(dǎo)致DNA入殼復(fù)合物與復(fù)制復(fù)合物的“沖突”。然而，DNA復(fù)制時(shí)單鏈取代并非驅(qū)動(dòng)DNA入殼的直接動(dòng)力，因?yàn)閱捂溔〈姆较蚝虳NA入殼的方向不同。因此，DNA復(fù)制和入殼可能并沒(méi)有機(jī)制上的直接聯(lián)系。利用免疫共沉淀技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，AAV DNA、Cap以及Rep蛋白都定位于核內(nèi)且相互關(guān)聯(lián)，表明AAV基因組的復(fù)制與衣殼化可能同時(shí)發(fā)生。Myers和Carter在1980年的時(shí)候就提出，經(jīng)過(guò)復(fù)制、單鏈取代產(chǎn)生的ssDNA與衣殼裝配前體相連[32]。如果在衣殼化時(shí)沒(méi)有大量衣殼的積累，dsDNA形式的基因組就不會(huì)轉(zhuǎn)變成ssDNA，這就表明ssDNA的形成依賴(lài)于衣殼蛋白。

Rep40是SF3螺旋酶家族的一員，在結(jié)構(gòu)上與AAA+馬達(dá)蛋白相似[33]。Rep40結(jié)合DNA無(wú)需識(shí)別特殊的 DNA結(jié)構(gòu)，但是單體狀態(tài)的 Rep40并沒(méi)有或者只有極低的ATPase活性，Rep40的激活不但需要ATP，還需要有DNA的存在。ATP能誘導(dǎo)Rep40發(fā)生構(gòu)象變化，使之能與DNA結(jié)合，Rep40與DNA結(jié)合后，導(dǎo)致DNA構(gòu)象的變化，這種變化反過(guò)來(lái)促進(jìn) Rep40的聚合，發(fā)揮 ATPase的功能[34]。Rep40和SV40T抗原具有很大的的相似性，可能告知我們它是以6聚體的形式發(fā)揮功能[35]。

2.8 Rep-Cap連接在ssDNA入殼過(guò)程中的作用

ssDNA被認(rèn)為是通過(guò)Rep作用而定位于衣殼表面的，但是Rep和Cap的反應(yīng)并不需要ssDNA的參與就能發(fā)生[24]。Rep-Cap反應(yīng)可以在衣殼形成之間就開(kāi)始，Rep-Cap反應(yīng)不但在體內(nèi)共表達(dá)的時(shí)候可以發(fā)生，就是在體外兩類(lèi)蛋白共孵育也能發(fā)生，只是Rep-Cap反應(yīng)的效率和產(chǎn)物的穩(wěn)定性不如體內(nèi)。盡管 4種 Rep蛋白都能與 Cap發(fā)生反應(yīng)，但是在Rep-Cap復(fù)合物中，Rep蛋白的數(shù)量依次為Rep52、Rep78、Rep68、Rep40。是否 4種Rep都參與了DNA的錨定以及入殼還有待于進(jìn)一步研究。

那么衣殼表面的哪個(gè)部位才是Rep結(jié)合的位點(diǎn)呢？因?yàn)閟sDNA被認(rèn)為是通過(guò)五倍軸頂端的小孔進(jìn)入衣殼的，研究者將注意力集中于對(duì)小孔的研究。對(duì)小孔周?chē)膸讉€(gè)主要氨基酸進(jìn)行突變，研究發(fā)現(xiàn)V221W、L336W以及D219/L336W只是降低DNA的包裝效率，并不能完全阻止 DNA進(jìn)入衣殼[36]。作者認(rèn)為，這些突變的結(jié)果可能是導(dǎo)致衣殼蛋白與Rep的結(jié)合能力降低所致。T329A/T330A是所有突變中包裝效率最差的，同時(shí)也是Rep-衣殼反應(yīng)最差的突變體。Rep-衣殼蛋白結(jié)合能力的降低并不影響被包入衣殼DNA的完整性，突變的結(jié)果只是影響了Rep-DNA錨定衣殼的成功率。但是這些實(shí)驗(yàn)并不能排除小孔突變對(duì)DNA進(jìn)入具有直接的影響。另外，如果將HI的多肽序列全部替換成甘氨酸序列，雖然能形成衣殼，但是這一衣殼無(wú)法包裝DNA[9]。這種取代的結(jié)果是將原有HI環(huán)上與相鄰亞單位EF環(huán)反應(yīng)的側(cè)鏈氨基酸去除，從而可能影響DNA的包裝。

觀察兩組患者護(hù)理后的血壓、甘油三酯和總膽固醇以及纖維蛋白原的變化水平。利用日常生活活動(dòng)能力評(píng)分表(ADL)對(duì)兩組患者護(hù)理后的日常生活能力進(jìn)行評(píng)分,分值為0~100分,分?jǐn)?shù)越高表示活動(dòng)能力越好。

3 結(jié)論

AAV衣殼蛋白的裝配和 DNA的衣殼化是rAAV制備過(guò)程中兩個(gè)最為重要的過(guò)程。雖然我們對(duì)這兩個(gè)過(guò)程有了總體上的認(rèn)識(shí)，然而許多細(xì)節(jié)還無(wú)法知曉。例如，AAV如何能保證60個(gè)衣殼蛋白正確地裝配成衣殼，Rep蛋白在衣殼裝配過(guò)程中有什么作用，參與 DNA入殼的 Rep到底是哪一個(gè)或哪幾個(gè)，五倍軸小孔在DNA入殼過(guò)程中到底扮演什么角色等等。AAV衣殼蛋白的裝配和DNA的衣殼化的詳細(xì)分子機(jī)制、構(gòu)效關(guān)系仍需完善和充實(shí)。AAV病毒本身相關(guān)機(jī)制的深入研究有助于改善 rAAV載體的制備技術(shù)，促進(jìn)rAAV基因藥物研發(fā)。

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Capsid assembly and DNA encapsidation of adeno-associated virus

Qizhao Wang1,2, Yinghui Lü1,2, Zhaofa Li1,2, Yong Diao1,2, and Rui’an Xu1,2
1 Institute of Molecular Medicine, Huaqiao University, Quanzhou 362021, China
2 Molecular Medicine Engineering Research Center, Ministry of Education, Quanzhou 362021, China

Received: July 27, 2010; Accepted: October 9, 2010

Supported by: National S&T Major Special Project on Major New Drug Innovation (No. 2009ZX09103-643), National Science Foundation of China(No. 30900822), Natural Science Key Project of Fujian Province, China (No. 2010Y0036), Natural Science Project of Huaqiao University (No.07BS301).

Corresponding author: Qizhao Wang. Tel: +86-595-22690838; Fax: +86-595-22690516; E-mail: lyh4444@hqu.edu.cn

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng) (No. 2009ZX09103-643)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 30900822)，福建省重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 2010Y0036)，華僑大學(xué)校基金 (No. 07BS301) 資助。