雄黃對大鼠和兔的胚胎/胎仔的發(fā)育毒性

谷穎敏，吳韜奮，黃珍禎，趙 源，樊海艇，吳文斌，米金霞，張超超，湯家銘

(上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，上海 201203)

雄黃是一種常用的礦物質(zhì)中藥，其功能為解毒殺蟲、燥濕祛痰和截瘧，廣泛用于復(fù)方中藥和中成藥中。但雄黃有毒，雄黃內(nèi)服宜慎，不可久用，孕婦禁用［1］。被2010年版《中華人民共和國藥典》收載為72種有毒中藥之一。但目前雄黃對孕婦影響的臨床報道以及雄黃的生殖毒性實驗研究報道很少，在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)雄黃對大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育［2］、孕大鼠母體和胚胎/胎仔發(fā)育［3］無明顯毒性作用。為了了解雄黃對不同種屬生殖毒性的影響，本研究采用孕大鼠和孕兔進行了胚胎/胎仔發(fā)育毒性實驗的比較，探討雄黃的生殖毒性。

1 材料與方法

1.1 試劑和藥品

雄黃飲片，批號H2007052401，水飛處理后保存，含量95.5%，產(chǎn)自湖南石門雄黃礦業(yè)，由上海市食品藥品檢驗所提供。環(huán)磷酰胺(陽性對照)，規(guī)格:每安瓿0.2 g，批號10102921，購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。沙利度胺原料藥，白色粉末狀，純度99.23%，批號:120101，購自湖北大仝生物化工科技有限公司。

0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，批號F20090508，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 動物

清潔級SD大鼠，雌性體質(zhì)量180～230 g，雄性體質(zhì)量300～350 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，飼養(yǎng)于本中心屏障系統(tǒng);普通級新西蘭兔，雌性體質(zhì)量≥2.5 kg，交配后第4天由新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場提供，飼養(yǎng)于本中心普通級兔飼養(yǎng)室。動物許可證號:SYXK(滬)2009-0069，常規(guī)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境指標(biāo)控制在國標(biāo)規(guī)定的范圍內(nèi)。

1.3 交配及分組

大鼠以雌雄2∶1比例同居。次日上午用大鼠陰道內(nèi)精子檢查法確認交配。未交配成功者繼續(xù)進行合籠交配，交配成功者按體質(zhì)量分層隨機分組，分為正常對照組、環(huán)磷酰胺(陽性對照)組、雄黃125，250和550 mg·kg－1組共5 組，每組17～19 只。

孕兔隨機分為正常對照組、沙利度胺(陽性對照)組、雄黃31.3，62.5 和125 mg·kg－1組共5 組，每組孕兔最終達到8只以上。

1.4 動物給藥及一般狀態(tài)觀察

大鼠從懷孕第6天～第15天ig給予雄黃125，250 和 550 mg·kg－1(按 1 ml/100 g)，每天1次，共10 d，陽性對照組大鼠于懷孕第10天im注射給予環(huán)磷酰胺按10 mg·kg－1，正常對照組大鼠給予等容量的 0.5%羧甲基纖維素鈉。兔按10 ml·kg－1給藥，從懷孕第6天 ～第18天 ig給予雄黃 31.3，62.5和 125 mg·kg－1，每天 1 次，共13 d。兔陽性對照ig給予沙利度胺按200 mg·kg－1，每天1次，共13 d。給藥期間按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

各實驗組在給藥期和停藥后恢復(fù)期，每天觀察行為活動、呼吸、皮毛、陰道分泌物、糞、尿等，進行體質(zhì)量和攝食量測定。

1.5 母體體質(zhì)量稱量以及胎仔質(zhì)量等的檢測

孕大鼠于妊娠第20天進行解剖，孕兔于妊娠第29天解剖。

稱量子宮、卵巢，觀察并記錄胎仔外觀、黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、胎盤總質(zhì)量、胎盤外觀、胎仔體質(zhì)量、胎仔性別，測量胎仔頂臀長和尾長，并計算著床數(shù)及晚期胚胎流失率。

取1/2胎仔經(jīng)固定和茜素紅S應(yīng)用液染色后用于骨骼檢查，取另1/2胎仔用Bouin液固定后用于內(nèi)臟檢查。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 雄黃對孕大鼠和孕兔母體的一般情況的影響

在實驗期間，與正常對照組相比，孕大鼠雄黃125，250和550 mg·kg－1組和陽性對照組未見明顯的外觀異常，被毛光澤，活動佳，大便正常(呈雄黃色)。雄黃組體質(zhì)量增長未發(fā)生明顯的變化，與正常對照組比較無明顯差異。

與正常對照組相比，孕兔雄黃125 mg·kg－1組給藥后攝食量逐漸減少，部分母兔不進食，同時糞便也逐漸減少;給藥3 d后，部分孕兔出現(xiàn)消瘦、被毛雜亂和無光澤等現(xiàn)象，并且活動逐漸減少，之后母兔陸續(xù)發(fā)生死亡(10/18);停止給藥后，母兔攝食量逐漸恢復(fù)，其他異常也逐漸消失。雄黃 62.5和31.3 mg·kg－1組給藥后孕兔也出現(xiàn)不同程度攝食量減少，個別孕兔逐漸消瘦、死亡(雄黃62.5 mg·kg－1組死亡1/10，31.3 mg·kg－1組死亡2/11)。

2.2 雄黃對孕大鼠和孕兔胚胎的形成及胎仔一般生長發(fā)育指標(biāo)的影響

2.2.1 雄黃對孕大鼠和孕兔子宮、胎仔和胎盤質(zhì)量的影響

與正常對照組相比，雄黃 125，250和550 mg·kg－1組對孕大鼠子宮連胎質(zhì)量、子宮凈質(zhì)量及胎仔總質(zhì)量及胎盤總質(zhì)量等指標(biāo)有隨著劑量的增加而下降的趨勢，但與正常對照組比較無顯著意義。而陽性對照環(huán)磷酰胺組的各項指標(biāo)均明顯低于正常對照組(P＜0.01)(表1)。

Tab.1 Effect of realgar on mass of uteruses，fetuses，and placenta in pregnant rats

如表2所示，與正常對照組相比，雄黃31.3，62.5 和125 mg·kg－1組對孕兔子宮連胎質(zhì)量、子宮凈質(zhì)量及胎仔總質(zhì)量及胎盤總質(zhì)量等指標(biāo)有隨著劑量的增高而下降的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。陽性對照沙利度胺組的各項指標(biāo)與正常對照組比較亦無顯著差異。

2.2.2 雄黃對孕大鼠和孕兔胎仔存活的影響

如表3所示，與正常對照組相比，雄黃各劑量組的孕大鼠平均胎仔數(shù)、活胎數(shù)(率)無顯著差異，而陽性對照環(huán)磷酰胺組活胎率明顯降低(P＜0.01)，死胎率明顯升高(P＜0.01)。

如表4所示，與正常對照組活胎率90.90%比較，雄黃125和62.5 mg·kg－1組孕兔活胎率明顯降低，分別為45.76%和72.73%，且隨劑量的增高而降低，差異有極顯著意義(P＜0.01);陽性對照沙利度胺組及雄黃31.3 mg·kg－1組活胎率無顯著差異。

Tab.2 Effect of realgar on mass of uteruses，fetuses，and placentas in pregnant rabbits

Tab.3 Effect of realgar on average numbers of fetuses and living fetuses in pregnant rats

Tab.4 Effect of realgar on average numbers of fetuses and living fetuses in pregnant rabbits

2.2.3 雄黃對孕大鼠和孕兔晚期胚胎流失率的影響

如表5所示，與正常對照組比較，雄黃125，250和550 mg·kg－1組孕大鼠著床數(shù)、活胎數(shù)和晚期胚胎流失率差異無顯著意義，而陽性對照環(huán)磷酰胺組的晚期胚胎流失率明顯升高(P＜0.01)。

如表6所示，與正常對照組的9.09%比較，雄黃125 和62.5 mg·kg－1組孕兔晚期胚胎流失率明顯升高，且隨劑量的增高而顯著升高，分別為54.24%和27.27%(P ＜0.01);陽性對照沙利度胺組及雄黃31.3 mg·kg－1組晚期胚胎流失率雖然升高，但與正常對照組比較差異無顯著意義。

2.2.4 雄黃對孕大鼠和孕兔胎仔體質(zhì)量、頂臀長和尾長的影響

如表7所示，與正常對照組比較，雄黃250和125 mg·kg－1組孕大鼠的胎鼠體質(zhì)量、頂臀長及尾長指標(biāo)差異無顯著意義，但與正常對照組比較，雄黃550 mg·kg－1組和陽性對照環(huán)磷酰胺組的胎鼠體質(zhì)量、頂臀長、尾長指標(biāo)均明顯降低(P ＜0.01)。

Tab.5 Effect of realgar on late fetus losing rate in pregnant rats

Tab.6 Effect of realgar on late fetus losing rates in pregnant rabbits

Tab.7 Effect of realgar on single fetus mass，tail length and crown-rump length in pregnant rats

如表 8所示，與正常對照組比較，雄黃31.3 mg·kg－1組孕兔胎仔體質(zhì)量和頂臀長明顯增加，雄黃25和125 mg·kg－1組胎仔體質(zhì)量、尾長和頂臀長無顯著差異;陽性對照沙利度胺組胎仔體質(zhì)量及頂臀長明顯升高(P＜0.05);尾長明顯縮短(P ＜0.01)。

2.3 雄黃對孕大鼠和孕兔胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟畸形的影響

2.3.1 雄黃對孕大鼠胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟畸形的影響

與正常對照組相比，雄黃 125，250和550 mg·kg－1組孕大鼠胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟，未見有畸形。陽性對照環(huán)磷酰胺組雖胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟未見畸形(表9)，但胎鼠的肋骨、胸骨、頸椎、胸椎、腰椎和骶椎骨的骨化數(shù)均明顯減少(資料未顯示)(P＜0.01)，表明環(huán)磷酰胺可影響骨骼的發(fā)育。

2.3.2 雄黃對孕兔胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟畸形的影響

如表10所示，與正常對照組比較，雄黃31.3，62.5 和 125 mg·kg－1組孕兔胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟，未見有畸形。陽性對照沙利度胺組出現(xiàn)胎仔外觀及骨骼畸形，外觀畸形率28%，骨骼畸形率19.64%，有顯著差異(P ＜0.01)。

Tab.8 Effect of realgar on single fetus mass，tail length and crown-rump length in pregnant rabbits

Tab.9 Effect of realgar on single number of apparent deformity，skeleton deformity and viscera deformity in pregnant rats

Tab.10 Effect of realgar on single number of apparent deformity，skeleton deformity and viscera deformity in pregnant rabbits

3 討論

關(guān)于雄黃的毒性，目前文獻大多局限于對含雄黃復(fù)方中成藥的一般毒性和毒代動力學(xué)研究［4－6］，而對雄黃的生殖毒性研究報道不多。在2010年版《中華人民共和國藥典》中有24種(4.6%)的中成藥含有雄黃，涉及常用藥物較多，如小兒清熱片、牛黃清心丸、牛黃解毒片和安宮牛黃丸等，因此正確評價雄黃的毒性對于指導(dǎo)臨床合理使用這些中成藥具有積極的作用。根據(jù)毒理學(xué)動物選擇的原則，證實一種藥物的毒性至少應(yīng)在2種不同種屬動物上進行實驗，為此，本實驗室在完成雄黃對大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性研究的基礎(chǔ)上，進一步用兔進行實驗，觀察比較雄黃對不同種屬動物生殖毒性的影響。

雄黃的毒性存在于可溶性砷中，不同產(chǎn)地雄黃的可溶性砷含量各不同［4］，為了使研究具有可比性，在實驗中統(tǒng)一用產(chǎn)自湖南石門雄黃礦業(yè)的批號為H2007052401的雄黃飲片作為供試品，經(jīng)上海市食品藥品檢驗所檢測，該批次雄黃總砷含量95.5%，可溶性砷含量3.32%。

在劑量設(shè)計上，2010年版《藥典》記載的雄黃劑量為0.05 ～0.1 g，按成人60 kg計算，最高臨床劑量約為1.7 mg·kg－1，折算成大鼠等效劑量約為10.5 mg·kg－1。在本研究中，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果設(shè)計大鼠雄黃實驗劑量為550，250和125 mg·kg－1組，根據(jù)計算［5］分別相當(dāng)于人等效劑量的52，24和12倍。在完成大鼠實驗后，根據(jù)大鼠的實驗結(jié)果決定兔的實驗劑量。

本研究結(jié)果顯示，孕大鼠并沒有表現(xiàn)明顯的母體毒性反應(yīng)，在胚胎/胎仔發(fā)育的指標(biāo)中，除了雄黃550 mg·kg－1組的胎仔體質(zhì)量、尾長和頂臀長與正常對照組比較差異有極顯著意義外，子宮連胎質(zhì)量、子宮凈質(zhì)量、胎仔總質(zhì)量、胎盤總質(zhì)量、平均胎仔數(shù)、活胎率和晚期胚胎流失率等指標(biāo)與正常對照組比較，差異無顯著意義;胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟均未見畸形，因而在孕兔的預(yù)實驗中用雄黃275 mg·kg－1(相當(dāng)于大鼠550 mg·kg－1組)灌胃給藥進行實驗。結(jié)果孕兔在給藥后2～5 d全部死亡，尸體解剖發(fā)現(xiàn)雄黃可能對心血管系統(tǒng)有毒性作用。在正式實驗中，兔的劑量設(shè)計選用大鼠雄黃250 mg·kg－1的等效劑量作為高劑量，設(shè)定雄黃 125，62.5和31.3 mg·kg－1，分別相當(dāng)于人等效劑量的 24，12和6倍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雄黃125 mg·kg－1組18只孕兔中10 只死亡，雄黃62.5 mg·kg－1組10只孕兔中1只死亡，雄黃31.3 mg·kg－1組11只孕兔中2只死亡。母體毒性反應(yīng)表現(xiàn)為攝食量減少、消瘦，且與劑量相關(guān)。

在孕兔胚胎-胎仔發(fā)育指標(biāo)中，各劑量組的子宮連胎質(zhì)量、子宮凈質(zhì)量、胎仔總質(zhì)量、胎盤總質(zhì)量、胎仔體質(zhì)量、尾長和頂臀長等指標(biāo)均隨著雄黃劑量的增加而明顯降低，但由于孕兔個體差異較大，表現(xiàn)為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差較大，并未顯示統(tǒng)計學(xué)差異。而雄黃62.5 和 31.3 mg·kg－1組的活胎率、晚期胚胎流失率與正常對照組比較，差異有極顯著意義。但是在兔胎仔外觀、骨骼和內(nèi)臟檢查中未發(fā)現(xiàn)有畸形。

比較孕大鼠和孕兔的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)大鼠對雄黃毒性相對不敏感，表現(xiàn)在550 mg·kg－1下(相當(dāng)于人等效劑量52倍)亦無明顯臨床毒性表現(xiàn)，雄黃250 和125 mg·kg－1下胚胎-胎仔發(fā)育指標(biāo)與正常對照組比較無明顯差異;而兔對雄黃毒性敏感，不僅有明顯的臨床表現(xiàn)，而且雄黃125和62.5 mg·kg－1組(分別相當(dāng)于人等效劑量24倍和12倍)的活胎率降低，晚期胚胎流失率升高。目前不清楚孕兔活胎率降低和晚期胚胎流失率的升高的原因，是由于雄黃對孕兔母體的間接毒性引起的還是雄黃對胎仔的直接毒性作用，但對孕大鼠和孕兔胎仔的外觀、骨骼和內(nèi)臟檢查結(jié)果，可以確認雄黃對大鼠和兔沒有明顯的致畸作用，這需要更深入的研究。

上述提示證明，雄黃對孕兔具有生殖毒性。這一實驗結(jié)果印證了中醫(yī)臨床千百年來對雄黃毒性“孕婦禁用”認識的正確性。

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