用于藥物研發(fā)的細(xì)胞色素P450酶3A4體外肝細(xì)胞模型的研究進(jìn)展

饒小惠，陳 鋒，潘明新，汪 艷

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院1.再生醫(yī)學(xué)研究所，2.肝膽二科，廣東廣州 510280)

藥物研發(fā)對(duì)醫(yī)療進(jìn)步有著十分重要的作用。20世紀(jì)80年代以來(lái)，針對(duì)心血管、腫瘤、消化系統(tǒng)和疼痛等疾病的新藥研發(fā)，為疾病治療提供了更多選擇，提高了健康水平、生活質(zhì)量及平均壽命［1］。藥物研發(fā)是一個(gè)昂貴而且耗時(shí)的過(guò)程，盡管隨著科技進(jìn)步及投入增加，但是仍然有90%的研發(fā)新藥不能成功進(jìn)入臨床。20世紀(jì)90年代以來(lái)，成功上市的新藥呈逐年下降趨勢(shì)，1996年有53種新藥通過(guò)美國(guó)FDA認(rèn)證，但是到2010年僅有15種［2］。導(dǎo)致新藥研發(fā)失敗的原因有很多，其中一個(gè)主要原因是研發(fā)后期出現(xiàn)的各種藥物毒性反應(yīng)和藥效作用不顯著;藥物研發(fā)過(guò)程會(huì)對(duì)候選藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)以及毒理學(xué)特征進(jìn)行確認(rèn)，但傳統(tǒng)研發(fā)體系缺乏在早期能夠準(zhǔn)確高效分析藥物代謝作用和毒性反應(yīng)的技術(shù)工具。

大部分藥物進(jìn)入體內(nèi)后的代謝過(guò)程主要經(jīng)肝細(xì)胞完成。肝細(xì)胞含有各種參與體內(nèi)外物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的酶類。細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP)是一類含血色素巰基結(jié)構(gòu)的單加氧酶蛋白超家族，是完成相關(guān)底物的去毒/生物活化作用的重要藥物代謝酶。其中，CYP3A亞家族在肝CYP中含量最高，約占30%，是主要的藥物代謝酶類。目前發(fā)現(xiàn) CYP3A包括有 CYP3A4，CYP3A5，CYP3A7及CYP3A43等。CYP3A4在肝細(xì)胞中含量最高達(dá)40%，其他組織如小腸、腎、肺和腦組織等也有CYP3A4的低水平表達(dá)。Ghosh等［3］近期研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4不僅參與了藥物代謝，還有保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用。CYP3A4參與了50%的臨床用藥的代謝過(guò)程，藥物代謝譜非常廣泛，激素、免疫抑制劑、鈣離子通道阻滯劑、咖啡因及抗生素等。其中硝苯地平、咪達(dá)唑侖及睪酮是CYP3 A4的特異性底物，常被用于CYP3A4活性水平檢測(cè)。有些藥物，如曲格列酮和胺碘酮等，經(jīng)CYP3A4代謝后能產(chǎn)生肝不良反應(yīng)，從而影響了其在臨床的應(yīng)用。一些環(huán)境致癌物質(zhì)(如黃曲霉素B1)也具有CYP3A4代謝依賴性的肝細(xì)胞毒性作用。另外，CYP3A4與藥物相互作用也是密切相關(guān)的，大量臨床用藥已被證明可以誘導(dǎo)或抑制CYP3A4的活性，使與這些藥物合用的其他藥物的血漿濃度降低或升高，導(dǎo)致聯(lián)合用藥的療效減弱或增強(qiáng)甚至產(chǎn)生毒性作用。如特非那定、米貝地爾、阿司咪唑及西伐他丁，由于藥物相互作用已經(jīng)退出了市場(chǎng)。

鑒于CYP3A4在藥物代謝過(guò)程中的重要作用，藥物研發(fā)過(guò)程需要一個(gè)能夠再現(xiàn)體內(nèi)CYP3A4代謝作用的體外模型，用來(lái)集中評(píng)價(jià)CYP3A4對(duì)備選藥物代謝作用和水平，以及備選藥物對(duì)CYP3A4活性作用的影響。以肝藥物代謝功能為主要對(duì)象，現(xiàn)今用于藥物開(kāi)發(fā)的體外模型有:①以亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)微粒體為作用單位的體外代謝模型。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)模型中，人肝細(xì)胞微粒體是現(xiàn)今最常用的體外模型，因?yàn)槠鋪?lái)源廣，價(jià)格低廉且使用簡(jiǎn)單。② 以細(xì)胞為作用單位的代謝模型(簡(jiǎn)稱，細(xì)胞模型)。超黏體(supersomes)是基因工程昆蟲(chóng)細(xì)胞產(chǎn)生的微粒體，含有較高活性的CYP3A4;其他體外模型還有含有微粒體成分的人肝細(xì)胞S9成分等［4］。這些體外模型無(wú)法真實(shí)反映體內(nèi)CYP3A4對(duì)藥物的代謝情況，也不能用于預(yù)測(cè)體內(nèi)藥物代謝水平的定量分析，因此應(yīng)用范圍有限。③組織器官代謝模型。組織和器官代謝模型是利用組織塊或完整器官進(jìn)行體外藥物代謝測(cè)試的模型。這些模型雖然在最大程度上保證了代謝主體的完整性，這無(wú)疑有利于最大程度地再現(xiàn)體內(nèi)代謝過(guò)程，但其來(lái)源罕有并且組織活性維持困難以及成本高，所以大多難以常規(guī)使用。

細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)最小的完整功能執(zhí)行者;而細(xì)胞模型是較單純的生化模型、細(xì)胞器模型，具有更能體現(xiàn)機(jī)體生理活動(dòng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能能力;較組織器官代謝模型，在技術(shù)應(yīng)用上具有更大的可行性。以細(xì)胞為基本功能單位成分的分析模型(cell－based assay，CBA)是現(xiàn)代藥物研發(fā)技術(shù)中受到推崇而日益增多使用的模型工具［5］。因此，本文綜述了目前已知的CYP3A4生理功能特征、表達(dá)調(diào)控機(jī)制以及基于已知相關(guān)機(jī)制進(jìn)行體外細(xì)胞模型構(gòu)建的細(xì)胞種類、構(gòu)建策略和方式。

1 CYP3A4的表達(dá)調(diào)控

清楚了解CYP3A4的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，是構(gòu)建理想相關(guān)細(xì)胞模型的前提和基礎(chǔ)理論之一。CYP3A4基因位于染色體7q21.1的P450酶基因簇。CYP3A4的生理性表達(dá)包括2個(gè)階段，分別為轉(zhuǎn)錄前調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。而轉(zhuǎn)錄前調(diào)控又可分為2個(gè)層面，一個(gè)是構(gòu)成性表達(dá)，即生理狀態(tài)下的持續(xù)表達(dá);另一個(gè)是誘導(dǎo)性表達(dá)，當(dāng)受到配基活性分子刺激后，表達(dá)量增加。

1.1 CYP3A4的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控

CYP3A4基因的5'開(kāi)放區(qū)長(zhǎng)35.8 kb，而只有13 kb才是肝特異性的調(diào)控區(qū)域，該區(qū)域包含了一系列的啟動(dòng)子及增強(qiáng)子元件(圖1)。

圖1 細(xì)胞色素氧化酶(CYP)3A 4細(xì)胞內(nèi)調(diào)控.CLEM:構(gòu)成性肝增強(qiáng)子模塊件;AP:激活蛋白;C/EBP:CCATT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白;HNF:肝細(xì)胞核因子;USF:上游刺激因子;prPXRE:孕烷X受體反應(yīng)元件;RXR:維A酸X受體;PXR:核因子X(jué)受體;XREM:外源性反應(yīng)增強(qiáng)模塊;CAR:雄甾烷受體;VDR:維生素D受體.

1.1.1 CYP3A4 的誘導(dǎo)性表達(dá)

CYP3A4的啟動(dòng)子位于調(diào)控序列的近端(－362/+53)，近端孕烷 X受體反應(yīng)元件(proximal pregnane－X－receptor response element，prPXRE)作為最小的啟動(dòng)子，是一個(gè)AG(G/T)TCA反向回文序列的六聚體，相互之間被6個(gè)核苷酸間隔開(kāi)。其次是位于CYP3A4轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－7.8 kb/－7.2 kb的一個(gè)遠(yuǎn)端外源性反應(yīng)增強(qiáng)子模塊(xenobiotic－responsive enhancer module，XREM)。核因子孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)是調(diào)控CYP3A4轉(zhuǎn)錄的一個(gè)最重要的轉(zhuǎn)錄因子，PXR與維甲酸X受體(retinoid X receptor，RXR)α形成異源二聚體，與prPXRE及XREM等元件發(fā)生結(jié)合，介導(dǎo)CYP3A4的誘導(dǎo)表達(dá)［6］。研究指出，PXR啟動(dòng)子及內(nèi)含子1的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)，與 CYP3A4 表達(dá)水平的多態(tài)性相關(guān)［7］。另有發(fā)現(xiàn)，人肝細(xì)胞中PXR的3'端非翻譯區(qū)可以被miR－148a識(shí)別，miR－148a表達(dá)水平與PXR蛋白水平呈反向關(guān)系，生理性地影響到CYP3A4的誘導(dǎo)性/構(gòu)成性表達(dá)水平。最近研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的與利福平激活CYP3A4轉(zhuǎn)錄相關(guān)的調(diào)控元件eNR3A4，主要由同向重復(fù)的α及β半位點(diǎn)組成，相互之間被4個(gè)核苷酸隔開(kāi)，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－7.6 kb處，是PXR激活CYP3A4轉(zhuǎn)錄必不可少的一個(gè)調(diào)控元件［8］。

1.1.2 CYP3A4 的構(gòu)成性表達(dá)

肝源性細(xì)胞中CYP3A4表達(dá)水平普遍較其他組織來(lái)源細(xì)胞高，逐漸發(fā)現(xiàn)肝組織有高表達(dá)的一系列特異性核因子，如肝細(xì)胞核因子(hepatic nuclear factor，HNF)4α，HNF1α，F(xiàn)oxA2，SP－1 和 FoxA3［9］等，參與了 CYP3A4 的構(gòu)成性表達(dá)。

構(gòu)成性肝增強(qiáng)子模塊(constitutive liver enhancer module，CLEM)4 位 于 － 11.4 kb/－ 10.5 kb，是 調(diào) 控CYP3A4構(gòu)成性表達(dá)的一個(gè)特異性重要元件。CLEM4長(zhǎng)900 bp，由一系列順式作用元件組成，HNF1α，HNF4α，上游刺激因子(upstream stimulatory factor 1，USF1)及 激活蛋白(activator protein，AP)1共同作用于CLEM4，協(xié)同激活該增強(qiáng)子的作用［10］。

在CYP3A4的5'開(kāi)放區(qū)還存在有幾個(gè)CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合 蛋 白 α (CCAAT enhancer－binding protein alpha，C/EBPα)的結(jié)合位點(diǎn)。C/EBP蛋白家族作為一類普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子參與了組織分化、炎癥反應(yīng)以及肝臟再生等多種生物學(xué)過(guò)程［11］。研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPα通過(guò)與 －121，－1393及－1659 bp 3個(gè)位點(diǎn)結(jié)合，參與了CYP3A4的構(gòu)成性表達(dá)。在肝細(xì)胞中，HNF3γ的結(jié)合位點(diǎn)位于－1718 bp處，并且與C/EBPα有協(xié)同作用，可以增強(qiáng)C/EBPα對(duì)CYP3A4的構(gòu)成性表達(dá)［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)突變，對(duì)CYP3A4誘導(dǎo)性表達(dá)也會(huì)產(chǎn)生影響。

C/EBPβ－肝激活蛋白(liver activating protein，LAP)及C/EBPβ－肝 抑 制 蛋 白 (liver inhibitory protein，LIP)是C/EBPβ的2種不同亞型，其作用的元件是一個(gè)新的288 bp的增強(qiáng)子，位于－5.59 kb處。在病理狀態(tài)下(如炎癥)，隨著2種亞型的比例變化，導(dǎo)致CYP3A4的表達(dá)水平發(fā)生變化［13］。此外，構(gòu)成性雄甾烷受體(constitutive androstane receptor，CAR)及維生素 D 受體(vitamin D receptor，VDR)也是調(diào)控CYP3A4表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子，作用位點(diǎn)與PXR相似，提示這些轉(zhuǎn)錄因子的靶基因作用具有重疊性特點(diǎn)，這也正是造成CYP3A4具有廣泛的作用底物譜的基礎(chǔ)機(jī)制之一。

最近研究還發(fā)現(xiàn)，微RNA通過(guò)對(duì)CYP3A4的3’端非翻譯區(qū)的干擾，對(duì)CYP3A4蛋白的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控;微RNA不僅能直接調(diào)控CYP3A4，還能干擾VDR和PXR等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而間接影響CYP3A4的表達(dá)［14］。

1.2 CYP3A4的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

CYP3A4不僅受到轉(zhuǎn)錄前的調(diào)控，還受到轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。在細(xì)胞漿中，CYP3A4轉(zhuǎn)錄翻譯后還會(huì)受到磷酸化修飾，主要發(fā)生在Ser478，Thr264及Ser420 3個(gè)氨基酸殘基，而且當(dāng)CYP3A4磷酸化后，使其易于泛素化而被降解［15］。

2 常用的CYP3A4體外細(xì)胞模型

用于藥物代謝的CYP3A4體外細(xì)胞模型分為肝源性及非肝源性(圖2)。常用的非肝源性細(xì)胞包括:細(xì)菌，酵母菌和昆蟲(chóng)細(xì)胞等。然而非肝源性細(xì)胞與肝源性細(xì)胞相比，其表達(dá)的藥物代謝酶種類單一，且缺少肝特異性因子，不能如實(shí)反映藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程，所以在體外藥物代謝分析過(guò)程中，使用肝源性細(xì)胞模型具有明確理論優(yōu)勢(shì)。常用的肝源性細(xì)胞模型主要包括原代肝細(xì)胞及肝細(xì)胞系。

圖2 用于藥物代謝的CYP3A4體外細(xì)胞模型

2.1 原代肝細(xì)胞在藥物代謝中的應(yīng)用

人原代肝細(xì)胞是最適合用于藥物代謝的CYP3A4體外細(xì)胞模型，它完整表達(dá)了Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶以及其他參與分子，能比較準(zhǔn)確地模擬藥物在人體內(nèi)的代謝作用，是體外藥物代謝的金標(biāo)準(zhǔn)［16］。目前，人原代肝細(xì)胞常用于CYP3A4相關(guān)的藥物代謝研究，如CYP3A4的時(shí)間依賴性抑制［17］和藥物相互作用等。但是由于細(xì)胞來(lái)源短缺，人群差異性大和體外培養(yǎng)細(xì)胞表型維持困難等缺點(diǎn)，所以廣泛應(yīng)用人原代肝細(xì)胞比較困難。由于人原代肝細(xì)胞來(lái)源稀缺，藥物篩選的實(shí)踐工作中還常常會(huì)用到動(dòng)物來(lái)源原代肝細(xì)胞。然而動(dòng)物來(lái)源肝細(xì)胞，常用如大鼠和豬原代肝細(xì)胞，與人類肝細(xì)胞的藥物代謝酶種類和代謝譜并不一致［18］。因此，目前有研究關(guān)注于尋找常用動(dòng)物肝細(xì)胞與人肝細(xì)胞的藥物代謝作用的相似性關(guān)系，希望提高動(dòng)物模型的預(yù)測(cè)價(jià)值。

2.2 細(xì)胞系體外模型在藥物代謝中的應(yīng)用

由于原代肝細(xì)胞來(lái)源有限以及體外培養(yǎng)困難等缺點(diǎn)，細(xì)胞系體外模型具有體外增殖能力，遺傳和功能表型相對(duì)穩(wěn)定，并且培養(yǎng)條件比較簡(jiǎn)單而易于實(shí)驗(yàn)室間統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，較原代肝細(xì)胞更便于用于藥物代謝CBA。細(xì)胞系可分為肝源性及非肝源性，常用于藥物代謝的非肝源性細(xì)胞系有Caco－2細(xì)胞，HeLa細(xì)胞等;Wahlang等［19］用1α，25－雙羥維生素D3 誘導(dǎo)的 Caco－2 單層細(xì)胞模型來(lái)研究它的膜通透性和代謝，發(fā)現(xiàn)CYP3A4的抑制劑伊曲康唑和P－糖蛋白的抑制劑維拉帕米可提高目標(biāo)化合物通透性，為增加該藥的口服生物利用度提供了新的途徑。而肝源性細(xì)胞系的生理功能與原代肝細(xì)胞更為相似，而且保留了部分藥物代謝酶活性，所以較非肝源性細(xì)胞更常用于藥物代謝。目前相關(guān)報(bào)道中常用的肝源性細(xì)胞系如下。

①HepG2是目前最常用的永生化肝癌細(xì)胞系，分離自高分化肝細(xì)胞腫瘤，就其各種肝性表型在分子和細(xì)胞水平的特點(diǎn)，也是了解得比較全面的細(xì)胞系。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，HepG2的CYP表達(dá)水平非常低下，如CYP3A4的mRNA及代謝活性比原代肝細(xì)胞低2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。但經(jīng)過(guò)不同方式的優(yōu)化后，這些分子表達(dá)水平有所提高，使HepG2成為廣泛用于CYP3A4相關(guān)的藥物代謝實(shí)驗(yàn)的最常用的體外細(xì)胞模型［20］。如 1，25－(OH)2D3，麝香保心丸及辣椒素等對(duì)CYP3A4表達(dá)的誘導(dǎo)作用［21－23］;五味子提取物對(duì) CYP3A4的抑制性研究［24］。

②HepaRG細(xì)胞分離自一例丙肝病毒陽(yáng)性女性患者的肝癌組織，早期常用于乙肝病毒研究［25］。當(dāng)接種密度低時(shí)，HepaRG細(xì)胞呈未分化的細(xì)長(zhǎng)形態(tài);加入二甲亞砜培養(yǎng)后隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，細(xì)胞能逐漸分化，形成典型的條索狀肝細(xì)胞樣克隆。而且，與HepG2細(xì)胞相比，HepaRG細(xì)胞能表達(dá)一系列的CYP酶，如CYP3A4，CYP2B6及CYP2C9等。因此，HepaRG細(xì)胞被認(rèn)為是原代肝細(xì)胞最理想的替代者，用于CYP3A4的藥物誘導(dǎo)及抑制研究［26－27］。最近，有學(xué)者優(yōu)化HepaRG的培養(yǎng)條件，用于藥物代謝及毒性研究［28］。

③BC2細(xì)胞來(lái)源于一例男性患者的肝腫瘤組織，可以在體外生長(zhǎng)同時(shí)分化，并能在幾周內(nèi)保持比較穩(wěn)定的分化狀態(tài)。分化后的細(xì)胞具有很強(qiáng)的蛋白、糖原及尿素的合成功能，表 達(dá) 一 系 列 的 CYP酶(CYP1A1/2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2C9，CYP2E1及CYP3A4)及Ⅱ相代謝酶。同時(shí)，BC2細(xì)胞對(duì)CYP酶誘導(dǎo)劑敏感，如加入地塞米松刺激后，CYP3A4表達(dá)可提高5倍［29］。之后該研究組在BC2細(xì)胞群中，以P－糖蛋白高水平表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出較BC2在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝酶方面表達(dá)水平高的亞細(xì)胞株［30］。

④Huh7細(xì)胞是另一種商業(yè)化并且被廣泛應(yīng)用的肝癌細(xì)胞系。Huh7細(xì)胞在體外增殖停止后，逐漸分化成熟。有學(xué)者通過(guò)基因芯片對(duì)分化成熟的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)P450酶，Ⅱ相代謝酶及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等表達(dá)明顯增高。特別是CYP3A4的代謝活性達(dá)到了原代肝細(xì)胞的30%，并且能被利福平誘導(dǎo)及酮康唑抑制。同時(shí)，Huh7細(xì)胞經(jīng)黃曲霉素B1處理后，可產(chǎn)生明顯的CYP3A4依賴性細(xì)胞毒性［31］。因此，Hosomi等［32］用 Huh7 細(xì)胞研發(fā)了一個(gè)高敏感性的檢測(cè)系統(tǒng)，研究藥物CYP3A4依賴性的細(xì)胞毒性，有利于藥物開(kāi)發(fā)早期的藥物篩選。

3 高表達(dá)CYP3A4的體外細(xì)胞模型建立及技術(shù)進(jìn)展

為了獲得一個(gè)準(zhǔn)確可靠的藥物研發(fā)體外細(xì)胞模型，隨著對(duì)肝細(xì)胞藥物代謝酶表達(dá)調(diào)控的深入了解和相關(guān)技術(shù)進(jìn)步，不斷嘗試通過(guò)各種辦法建立高表達(dá)CYP3A4的體外細(xì)胞模型。

3.1 永生化原代肝細(xì)胞

原代肝細(xì)胞保留了肝完整的功能，是研究藥物代謝的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，原代肝細(xì)胞在體外不能增殖，所以不能被廣泛推廣。學(xué)者們?cè)噲D通過(guò)讓原代肝細(xì)胞永生化，使其能在體外培養(yǎng)擴(kuò)增。原代肝細(xì)胞永生化的方法主要是轉(zhuǎn)染編碼腫瘤病毒基因、原癌基因或端粒酶的質(zhì)粒［33］。隨著研究的進(jìn)展，出現(xiàn)了雜交細(xì)胞，條件永生化肝細(xì)胞及從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物分離的細(xì)胞系。但是，原代肝細(xì)胞永生化后，細(xì)胞表型發(fā)生改變，特別是CYP3A4表達(dá)低下，所以并不適合用于CYP3A4相關(guān)性藥物代謝研究。

3.2 CYP3A4過(guò)表達(dá)體外細(xì)胞模型

肝源性細(xì)胞系普遍存在的主要問(wèn)題是處于去分化或低分化狀態(tài)，各類代謝酶表達(dá)水平低下或不全。因此，相關(guān)改造的核心目標(biāo)集中在如何恢復(fù)和提高肝特征功能表型。另一種改造細(xì)胞的方法是，通過(guò)轉(zhuǎn)染編碼CYP3A4的質(zhì)粒，在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)CYP3A4，提高細(xì)胞系在 CYP3A4相關(guān)性藥物代謝的應(yīng)用潛質(zhì)。各種各樣的非肝源性宿主細(xì)胞如細(xì)菌、酵母菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，已經(jīng)被成功改造。1991年，文獻(xiàn)報(bào)道在B淋巴細(xì)胞樣干細(xì)胞中成功表達(dá)［34］。1998年，Chen等［35］已成功在中國(guó)倉(cāng)鼠肺細(xì)胞中表達(dá)CYP3A4，并用于黃曲霉素B1、環(huán)磷酰胺及雜色曲霉素的代謝研究。HepG2作為應(yīng)用最廣泛的肝癌細(xì)胞系，大量文獻(xiàn)報(bào)道在HepG2中成功過(guò)表達(dá)CYP3A4，并用于CYP3A4相關(guān)的藥物代謝及毒性研究［36－37］。

3.3 可誘導(dǎo)CYP3A4過(guò)表達(dá)體外細(xì)胞模型

隨著對(duì)CYP3A4表達(dá)調(diào)控研究的深入，有學(xué)者認(rèn)為CYP3A4在細(xì)胞系中表達(dá)降低是由CYP3A4相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及輔助因子表達(dá)減少導(dǎo)致的。Nibourg等［38］比較了HepG2及原代肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，發(fā)現(xiàn) C/EBP α mRNA只達(dá)到原代肝細(xì)胞的15%，HNF3α是25%，HNF1α是40%。有學(xué)者通過(guò)轉(zhuǎn)染編碼特異性轉(zhuǎn)錄因子(C/EBPα，HNF3γ，PXR)的質(zhì)粒 ，成功在 HepG2提高了 CYP3A4的表達(dá)。Küblbeck等［39］改造出了一種嵌合轉(zhuǎn)錄因子，即在PXR及CAR末端加入一段很強(qiáng)的激活域，轉(zhuǎn)染C3A細(xì)胞后增強(qiáng)了CYP3A4的表達(dá)，特別是利福平誘導(dǎo)后，CYP3A4 mRNA提高了約30倍。雖然在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)CYP3A4的表達(dá)，但是仍然達(dá)不到原代肝細(xì)胞的表達(dá)水平。因?yàn)镃YP3A4在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，單個(gè)或若干個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)提高，并不能使CYP3A4的表達(dá)恢復(fù)到正常水平，所以還需對(duì)CYP3A4表達(dá)調(diào)控做進(jìn)一步的研究。

3.4 干細(xì)胞模型研究

盡管已有大量研究著力于提高CYP3A4的表達(dá)水平，但是至今仍無(wú)法獲得理想的CYP3A4體外細(xì)胞模型，學(xué)者們開(kāi)始尋求新的策略，如采用干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝樣細(xì)胞。干細(xì)胞具有多向分化及增殖功能，大量文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)不同的方法成功誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化成肝樣細(xì)胞，并對(duì)其基因蛋白及功能進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝樣細(xì)胞表現(xiàn)出很多肝特異性的表型［40］。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是一種從分化成熟體細(xì)胞逆向分化而來(lái)的干細(xì)胞，可以獲取不同遺傳背景人群的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，從而建立特異性的體外肝樣細(xì)胞模型進(jìn)行肝毒性研究［41－42］。然而，干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝樣細(xì)胞表達(dá)CYP3A4水平較低，在藥物代謝上受到一定限制，所以還有待進(jìn)一步提高功能。再如，依據(jù)肝組織生理結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)合生物材料和微加工技術(shù)等，構(gòu)建模擬肝臟微環(huán)境的三維細(xì)胞培養(yǎng)體系，可以獲得包括藥物代謝酶在內(nèi)的多種肝性特征表型遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)培養(yǎng)系統(tǒng)的肝細(xì)胞模型［43－45］。這些模型在藥物代謝、毒理以及病理學(xué)的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究方面都正在產(chǎn)生越來(lái)越重要的影響。

4 展望

生理性體外細(xì)胞模型在藥物研發(fā)過(guò)程中具有重要應(yīng)用價(jià)值，原代肝細(xì)胞模型仍然是其中金標(biāo)準(zhǔn)。很多研究正在逐漸對(duì)肝源性和非肝源性細(xì)胞系進(jìn)行改造，使其中CYP酶的表達(dá)能力更接近于原代肝細(xì)胞水平。尤其是關(guān)于CYP3A4研究比較傾向于豐富和成熟。獲得能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)CYP3A4依賴性藥物代謝的體外細(xì)胞模型是本領(lǐng)域的研究目標(biāo)，為此，學(xué)者們嘗試了各種方法，如改良培養(yǎng)條件;采用基因工程的辦法在細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)CYP3A4或相關(guān)調(diào)控因子;肝細(xì)胞永生化等。雖然不斷進(jìn)步，但目前尚都不能達(dá)此目標(biāo)。干細(xì)胞研究，尤其是人胚胎干細(xì)胞及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的迅速進(jìn)展為CYP3A4依賴性模型的建立提供了新思路?，F(xiàn)在已經(jīng)可以通過(guò)各種辦法使其向肝樣細(xì)胞分化，并獲得不同程度和水平的各種肝特異性的功能;但如何使各方面表型達(dá)到成熟水平，還是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。新型生物工程學(xué)技術(shù)從構(gòu)建模擬肝組織生理微環(huán)境的角度，顯著提高了體外肝細(xì)胞模型的參考價(jià)值。將以上思路互相借鑒融合，有可能獲得預(yù)測(cè)能力顯著提高的CYP3A4藥物代謝體外細(xì)胞模型。

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