生鮮豬肉肌細(xì)胞內(nèi)外間隙和水分狀態(tài)與持水性的關(guān)系

李華健，陳 韜，楊波若，李燕清，卞健科，舒國濤

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

中國是豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)大國，2018年豬肉產(chǎn)量達(dá)5 404萬 t，約占世界豬肉總產(chǎn)量（1.13億 t）的48%[1]，豬肉品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著我國肉類工業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。肉的持水性即肉類保持自身水分和人為加入水分的能力[2-3]，是影響肉品質(zhì)量和企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的主要指標(biāo)之一，業(yè)內(nèi)常用汁液流失率來反映肉的持水性[4-5]。據(jù)估計(jì)，肉的汁液流失率每增加1%就可能給一個大型肉類加工廠每天造成數(shù)千元的經(jīng)濟(jì)損失[6]。所以，汁液流失形成的機(jī)制和控制技術(shù)一直是肉類科學(xué)研究的熱點(diǎn)。其中，肌肉微結(jié)構(gòu)變化與持水性的關(guān)系是主要研究方向之一。Huff-Lonergan等[7-8]提出肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變可以控制肌細(xì)胞和肌肉中水分的保留或損失，其認(rèn)為宰后僵直過程中肌細(xì)胞間和肌束間空隙（又稱為汁液流失通道）的形成會導(dǎo)致較多的汁液流失；李俠等[9]觀察到豬肉貯藏過程中纖維束間隙增大，不易流動水逐漸態(tài)變?yōu)樽杂伤?，肉的持水性降低；Sch?fer等[10]的研究表明肌細(xì)胞外間隙面積的變化解釋了汁液流失率變異的39%。由于大多數(shù)研究采用光學(xué)顯微鏡觀測肌肉微觀結(jié)構(gòu)，不能分清汁液流失通道形成于肌細(xì)胞內(nèi)還是肌細(xì)胞外，所以，汁液流失通道形成位置依然存在爭議。如Kristensen[11]和Bertram[12]等認(rèn)為汁液流失通道形成于肌細(xì)胞外，而Lawson等[13]的汁液流失通道形成假說則認(rèn)為汁液流失通道形成于肌細(xì)胞內(nèi)。近年來，低場核磁共振技術(shù)被廣泛應(yīng)用于肉與肉制品的水分狀態(tài)和含量的測定及相關(guān)研究中[14]。Han Minyi等[15]通過研究發(fā)現(xiàn)低場核磁共振的橫向弛豫時間（T2）和豬肉肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)變化具有良好的相關(guān)性。因此，本研究結(jié)合透射電子顯微鏡和低場核磁共振技術(shù)測定肌原纖維與肌細(xì)胞膜之間的距離（肌細(xì)胞內(nèi)間隙）、肌細(xì)胞之間的距離（肌細(xì)胞外間隙）和不同狀態(tài)水分的相對含量，分析它們與汁液流失率的關(guān)系，以便更好地了解汁液流失形成的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇品種相同、 飼養(yǎng)條件相同、 體質(zhì)量（（105±5）kg）相似的商品肉豬在曲靖市某商業(yè)屠宰廠進(jìn)行屠宰。

體積分?jǐn)?shù)25%戊二醛、乙醇（均為分析純） 廣東西隴化工廠；丙酮（分析純） 湖北齊飛醫(yī)藥化工有限公司；環(huán)氧樹脂（Epon-618） 天門恒昌化工有限公司；檸檬酸鉛 湖北津樂達(dá)化工有限公司；醋酸鈾 北京中科光析化工技術(shù)研究所；四氧化鋨 山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；二甲苯（分析純） 上海試劑廠；甲醛（分析純） 汕頭市達(dá)濠精細(xì)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H I 9 0 2 5 C 便攜式p H 計(jì) 意大利哈納公司；CR-400/410色差儀 日本美能達(dá)公司；JEM-1011透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；R型超薄切片機(jī)切片德國徠卡公司；NMI20-Analyst核磁共振成像分析儀上海紐邁電子科技有限公司；1、2 cm雙片刀由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 生鮮豬肉的處理及分組

按照Warner等[16]的方法，根據(jù)宰后45 min的pH值和肉色選擇出10 條疑似正常背最長肌肉和10 條疑似PSE（pale, soft, exudative）背最長肌肉。于宰后不同時間點(diǎn)用背最長肌測定相關(guān)指標(biāo)，根據(jù)汁液流失率大小經(jīng)聚類分析，將樣品分為高汁液流失率組和低汁液流失率組。

1.3.2 pH值和肉色的測定

采用王娟等[17]的方法，在宰后45 min和24 h分別測定背最長肌的pH值、亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）。每個樣品測量3 次取平均值。

1.3.3 低場核磁共振測定肌肉中水分分布

在宰后12 h和24 h取背最長肌，參照黃子信等[18]的方法測定，具體操作修改如下：重復(fù)掃描次數(shù)為8、重復(fù)采樣等待時間為3 500 ms、模擬增益為20、數(shù)字增益為3、回波個數(shù)為2 000、譜寬為100 kHz。油樣預(yù)熱儀器30 min后，沿肌纖維方向?qū)⑷鈽臃指畛? cm（長）×1 cm（寬）×1 cm（高）大小的肉樣（約2.0 g），放入核磁小管中并在管口用塑封膜包住，在32 ℃、19 MHz共振頻率下，使用弛豫時間編輯CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈 沖 序 列 （ 9 0 ° 脈 沖 和1 8 0 ° 脈 沖 之 間 的 時 間τ＝200 μs）進(jìn)行測定，反演得到不同狀態(tài)水的相對峰面積比例（相對含量），每個樣品測定3 次，取平均值。

1.3.4 透射電子顯微鏡觀測肌肉微觀結(jié)構(gòu)變化

宰后45 min，3、9、12 h和24 h在背最長肌上切取4 mm（長）×2 mm（寬）×2 mm（高）的肉樣放入體積分?jǐn)?shù)3.5%戊二醛溶液中固定，保藏在4 ℃環(huán)境中，用于透射電子顯微鏡觀測。樣品的處理參照Luo Xin等[19]的方法，即在4 ℃環(huán)境中，將固定好的各時間點(diǎn)樣品用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）沖洗3 次，每次10 min。之后用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸后固定1.5 h，分別用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行逐級脫水，每次15 min。用Epon-618滲透包埋，采用超薄切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色后用透射電子顯微鏡放大4 000 倍對每個樣品拍攝5 張圖片，使用Image-Pro Plus 5.1軟件測定肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的平均距離。

1.3.5 汁液流失率的測定

參照Honikel等[20]的方法測定汁液流失率，并略作修改：宰后24 h，在13肋處切取2.5 cm厚背最長肌一片，稱質(zhì)量m1，懸于塑料袋中，充氣，肉樣不能和塑料袋接觸，在4 ℃下吊掛24 h，取出稱質(zhì)量m2，汁液流失率按下式計(jì)算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件計(jì)算數(shù)據(jù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并進(jìn)行Duncan多重比較、獨(dú)立性T檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析和逐步回歸分析。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析之前先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，根據(jù)GB/T 4882—2001《數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋正態(tài)性檢驗(yàn)》[21]，只有宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙不服從正態(tài)分布，經(jīng)lgx轉(zhuǎn)換后服從正態(tài)分布，使用轉(zhuǎn)換后的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉樣汁液流失率的聚類分析結(jié)果

根據(jù)樣品汁液流失率的大小進(jìn)行聚類分析。如圖1所示，當(dāng)歐氏距離增至10.5時，將20 個樣品分成高汁液流失率組（n＝10）和低汁液流失率組（n＝10），兩組汁液流失率的范圍分別為5.01%～6.36%和0.57%～3.98%。

圖1 樣品汁液流失率的聚類分析樹狀圖Fig. 1 Dendrogram obtained from cluster analysis of the drip loss rate of pork samples

2.2 兩組肉樣的pH值和肉色比較結(jié)果

如表1所示，宰后45 min，低汁液流失率組的pH值極顯著高于高汁液流失率組（P＜0.01），L*值極顯著低于高汁液流失率組（P＜0.01），此結(jié)果與何凡等[22]將不同品種羊肉分為不同滴水損失組所測得結(jié)果一致。Chmiel等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)，與正常肉相比，宰后24 h，汁液流失嚴(yán)重的PSE肉具有較低的pH值和較高的L*、a*和b*值。綜上，說明高低汁液流失率組之間的pH值和肉色存在一定的差異。

表1 高低汁液流失率組肉樣的肉質(zhì)指標(biāo)（n＝ 10）Table 1 Meat quality attributes of pork samples from high and low drip loss rate groups (n= 10)

2.3 低場核磁共振橫向弛豫時間（T2）分析結(jié)果

利用低場核磁共振反演計(jì)算的各個峰面積比例可以反映樣品中不同狀態(tài)水分的比例，峰面積比例變化情況可以表征樣品中不同狀態(tài)水分的分布狀態(tài)和流動遷移情況[24]。圖2為低場核磁共振測定的T2反演圖譜，出峰位置位于T2b（0.1～10 ms）、T21（10～100 ms）和T22（100～1 000 ms），分別對應(yīng)結(jié)合水、不易流動水和自由水，將3 種狀態(tài)水的相對含量分別記為P2b、P21及P22。由于結(jié)合水與非水組分結(jié)合的牢固程度不同會導(dǎo)致結(jié)合水出現(xiàn)2 個信號峰[25]。對于該組分，根據(jù)陳琳莉等[25]的方法將兩個峰面積比例疊加后得到結(jié)合水相對含量P2b。

圖2 宰后12 h和24 h肉樣的T2弛豫時間分布Fig. 2 Distribution of T2 relaxation time in pork samples at 12 h and 24 h post-mortem

不同狀態(tài)水的相對含量如表2所示，在宰后12 h和24 h，結(jié)合水相對含量（P2b）在高、低汁液流失率組之間都沒有顯著差異（P＞0.05）；宰后24 h，高汁液流失率組的不易流動水相對含量（P21）極顯著低于低汁液流失率組（P＜0.01），而自由水相對含量（P22）極顯著高于低汁液流失率組（P＜0.01）。這與甄少波等[24]的研究結(jié)果一致，表明P21和P22與汁液流失率的關(guān)系較為密切，汁液流失率越高的肉，其P22越大，P21越小。

表2 肌肉中3 種狀態(tài)水分相對含量的變化Table 2 Changes in relative contents of three water states in muscle at different times post-mortem

2.4 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的變化

從結(jié)構(gòu)上講，肌肉中的汁液流失與排水力（肌原纖維和細(xì)胞的收縮）、膜通透性、細(xì)胞骨架蛋白降解、汁液流失通道的形成以及蛋白質(zhì)之間的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[4]。Mohan等[26]認(rèn)為宰后肌肉的僵直會對肌肉的超微結(jié)構(gòu)和品質(zhì)性狀（特別是質(zhì)構(gòu)、嫩度和持水性）產(chǎn)生顯著影響。由于僵直過程中肌原纖維橫向和縱向收縮，水從肌原纖維內(nèi)轉(zhuǎn)移到肌漿中，并由細(xì)胞膜維持在肌細(xì)胞內(nèi)，使得肌細(xì)胞內(nèi)肌漿空間增大[4,27]。所以在本研究中觀察到肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的增加。

如圖3所示，在宰后45 min，低汁液流失率組肉樣肌原纖維結(jié)構(gòu)排列緊密整齊，細(xì)胞膜附著在外肌原纖維上，只有輕微的分離（圖3A1）；與此相反，高汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙比低汁液流失率組大，肌原纖維之間相互分離，膜也呈現(xiàn)大面積分離（圖3A2）；宰后12 h，低汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙有所增加，肌細(xì)胞膜從外肌原纖維上分離（圖3B1），相對于低汁液流失率組，高汁液流失率組肌細(xì)胞膜與外肌原纖維呈現(xiàn)更大程度的分離，肌細(xì)胞外間隙也更大（圖3B2）；宰后24 h，低汁液流失率組肌細(xì)胞膜呈現(xiàn)更大程度的分離，肌細(xì)胞外間隙也變得更大（圖3C1），高汁液流失率組肌細(xì)胞外間隙相對宰后12 h稍微變小，肌細(xì)胞膜依然呈現(xiàn)大面積的分離（圖3C2）。Veiseth-Kent等[28]對宰后13 d的牛肉微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察也發(fā)現(xiàn)肌束膜從肌纖維上脫離，肌纖維間產(chǎn)生空隙。Chmiel等[23]的研究結(jié)果表明，宰后24 h正常肉的肌肉組織還保持相對完整，而PSE肉的肌肉組織遭到破壞。說明宰后早期高汁液流失率肉樣比低汁液流失率肉樣的微觀結(jié)構(gòu)變化更明顯。

圖3 宰后45 min（A）、12 h（B）和24 h（C）不同汁液流失率肉樣的透射電子顯微鏡圖Fig. 3 Transmission electron micrographs of muscle samples with different drip loss rate at 45 min (A), 12 h (B) and 24 h (C) post-mortem

為量化宰后豬肉肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化，使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 5.1對肌細(xì)胞內(nèi)間隙和肌細(xì)胞外間隙進(jìn)行測量。如表3所示，低汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)外間隙在宰后逐漸增大，宰后12 h和24 h沒有顯著差異，但都顯著大于宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)外間隙（P＜0.05）。高汁液流失率組肌細(xì)胞內(nèi)外間隙宰后的變化不同于低汁液流失率組，高汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后12 h達(dá)到最大，而后呈減小趨勢，肌細(xì)胞外間隙在宰后12 h達(dá)到最大，在宰后24 h顯著減?。≒＜0.05）。Sch?fer等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)肌纖維束之間的空隙面積在3～9 h逐漸增大，在9～24 h減小?？赡苁怯捎诠羌艿鞍捉到廨^快使得肌原纖維間連接遭到破壞產(chǎn)生橫向膨脹[4,11]，導(dǎo)致汁液流失率高的肉肌細(xì)胞內(nèi)外間隙減小。

高汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min顯著大于低汁液流失率組（P＜0.05）。高汁液流失率組的肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h 顯著大于低汁液流失率組（P＜0.05）。表明宰后高汁液流失率組的肌原纖維收縮更快，形成的空隙更大。這與Hughes等[27]認(rèn)為汁液流失率高的肉肌原纖維結(jié)構(gòu)收縮更快，細(xì)胞外空隙面積更大的觀點(diǎn)一致。較大的空隙會導(dǎo)致肌細(xì)胞外毛細(xì)管力減弱，使得肌細(xì)胞外自由水容易形成汁液流失[29]。采用低場核磁共振觀察到高汁液流失率組的P22高于低汁液流失率組（表2）也證實(shí)了這一現(xiàn)象。

表3 兩組肉樣肌細(xì)胞內(nèi)外間隙的差異（n＝10）Table 3 Intra- and extracellular spaces in muscle samples from low and high drip loss groups (n= 10)

2.5 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙、不同狀態(tài)水分相對含量和汁液流失率間的相關(guān)性和回歸分析結(jié)果

表4 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙、不同狀態(tài)水分相對含量和汁液流失率間的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of intra- and extracellular spaces of myocytes with relative contents of three water states and drip loss rate

魏秀麗等[30]的研究結(jié)果表明結(jié)合水與不易流動水呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），不易流動水與自由水呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），不同狀態(tài)水之間存在相互“態(tài)變”。本研究結(jié)果與之相似（表4），在宰后12 h，P2b與P21呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），P21與P22呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。在宰后24 h，P2b與P22呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），P21與P22呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。結(jié)果表明3 種狀態(tài)水確實(shí)如魏秀麗等[30]所述，結(jié)合水會“態(tài)變”為不易流動水，不易流動水與自由水可以發(fā)生相互“態(tài)變”。

肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min與宰后12 h和24 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。肌細(xì)胞外間隙在宰后45 min與宰后12 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），在宰后9 h與宰后24 h的P21呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表4）。宰后9 h的肌細(xì)胞外間隙解釋了宰后24 hP21變異的15.7%（表5），相關(guān)系數(shù)＝標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)＝-0.449。說明宰后9 h的肌細(xì)胞外間隙對宰后24 h的不易流動水影響最大，肌細(xì)胞外間隙越大，不易流動水含量越少。

宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙與宰后12 h和24 h的P22呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）（表4），解釋了宰后24 hP22變異的24.8%（表5）。說明在肌細(xì)胞內(nèi)外間隙中，宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙對P22的直接影響較大，宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大自由水含量越多。

表5 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙解釋宰后24 h的P21和P22變異的逐步回歸模型Table 5 Stepwise regression models for explaining variation in P21 and P22with intra- and extracellular spaces of myocytes

肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min和3 h與汁液流失率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h與汁液流失率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）（表4）。宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙解釋了汁液流失率變異的45.3%（表6）。說明宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙對汁液流失率的貢獻(xiàn)較大，且標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)和相關(guān)系數(shù)都為正，表明宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大，汁液流失率越高。

P2b在宰后12 h和24 h與汁液流失率均沒有顯著相關(guān)性（P＞0.05），P21與汁液流失率呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.0 1），P22與汁液流失率呈顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01）（表4）。表明結(jié)合水與汁液流失率關(guān)系不大，不易流動水和自由水會對汁液流失率產(chǎn)生顯著影響，這與王娟[17]、魏心如[31]和Bertram[32-33]等的研究結(jié)果一致。繼續(xù)將宰后12 h和24 h時3 種狀態(tài)水的相對含量與汁液流失率建立逐步回歸模型（表6），結(jié)果只有宰后24 h的P22進(jìn)入模型，解釋了汁液流失率變異的39.5%，標(biāo)準(zhǔn)偏回歸系數(shù)達(dá)0.655，相關(guān)系數(shù)為0.646。表明3 種狀態(tài)水中自由水對汁液流失率的影響最大，自由水越多，汁液流失率越高。

表6 肌細(xì)胞內(nèi)外間隙和不同狀態(tài)水分相對含量解釋汁液流失率變異的逐步回歸模型Table 6 Stepwise regression models for explaining variation in drip loss rate with intra- and extracellular spaces of myocytes and relative contents of different water states

3 結(jié) 論

生鮮豬肉在僵直過程中，肌原纖維的收縮會導(dǎo)致肌細(xì)胞內(nèi)和肌細(xì)胞外都形成汁液流失通道。高汁液流失率樣品的肌細(xì)胞內(nèi)間隙形成較早，高、低汁液流失率組的肌細(xì)胞內(nèi)間隙在宰后45 min已有明顯差異，而肌細(xì)胞外間隙在宰后9 h才有差異。宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙可以較好地解釋自由水含量和汁液流失率的變異，宰后45 min的肌細(xì)胞內(nèi)間隙越大，后期肌肉中自由水含量越多，汁液流失率越高，持水性越差。