I類組蛋白脫乙?；阜肿釉谕庵苎獑魏司奘杉毎械谋磉_與特應(yīng)性皮炎發(fā)病的相關(guān)性

肖德奇，喬建甌，袁定芬

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院，上海200233；2.上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011）

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是與遺傳有關(guān)的，具有產(chǎn)生IgE傾向的一種慢性、難治性、瘙癢性、炎癥性皮膚病[1]。AD真皮浸潤細胞主要是T淋巴細胞，其次為抗原呈遞細胞、肥大細胞及巨噬細胞[2]。其中單核-巨噬細胞在AD發(fā)病中的作用受到越來越多的關(guān)注。外周血中單核細胞進入真皮層后也稱為朗格漢斯細胞（langerhans cell，LC），AD慢性皮損內(nèi)LC數(shù)量明顯增多。LC表面的IgE受體（CD23）與IgE結(jié)合,結(jié)合后的IgE對特異性抗原有高親和力的捕獲功能，使LC也具有高效[3]。

組蛋白脫乙?；福╤istone deacetylase,HDAC）可以通過去除組蛋白賴氨酸上的乙?；鶊F來調(diào)控基因的表達，是表觀遺傳學(xué)中的重要分子。目前發(fā)現(xiàn)的HDAC家族分三類共11個分子，其中HDAC1，HDAC2，HDAC3和HDAC8屬于Ⅰ類分子[4]。有文獻表明，HDACⅠ類家族抑制劑可以促進單核巨噬細胞表達白細胞介素（IL）-10、IL-4，而抑制干擾素（IFN）-γ、IL-12 的表達[5]。IL-10、IL-4 均能誘使 Th2方向免疫反應(yīng)，促進AD的發(fā)生發(fā)展。在本研究中，通過定量PCR檢測對比AD患者和正常人外周血巨噬細胞中HDAC I類家族的表達，篩出與AD相關(guān)的具體HDAC分子，并研究其與AD發(fā)病的相關(guān)性和臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象來源 AD組患者10例，均符合英國Williams提出來的AD診斷標準。來源于我院門診，年齡3～62歲，平均35.1歲，病程1～32年，平均6.3年。排除妊娠及哺乳期婦女、1個月內(nèi)全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素者、正患上和（或）下呼吸道感染者以及患自身免疫性疾病者。正常對照組12例選自我院體檢的無過敏病史的健康人群，年齡22～55歲，平均37.2歲。

1.2 試劑和研究方法

1.2.1 Ficoll分離液常規(guī)分離人外周血單核細胞FACS液（PBS+2%BSA）懸浮細胞后加入FITC標記小鼠抗人CD11c單抗。孵育15 min后，F(xiàn)ACS液洗2遍，流式細胞儀分選外周血單核巨噬細胞。

1.2.2 RNA的提取與cDNA的合成 采用細胞總RNA Trizol試劑提取RNA，嚴格按照試劑說明書操作。用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。取RNA 4 μL，Oligo dT Primer 1 μL，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix 1 μL，5×PrimeScriptTMBuffer 4 μL，總反應(yīng)體系20μL。72℃5min，42℃60min，得到cDNA。

1.2.3 熒光定量PCR（SYBR Green法） HDAC1，HDAC2，HDAC3和 HDAC4以及 IL-10，IL-12的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均相同?？偡磻?yīng)體系20 μL，包括SYBR PremixExTaqTM10 μL，上下游引物各 1 μL，cDNA 模板 2 μL，dd H2O 6 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性 10 s，60℃退火加延長 40 s，共40個循環(huán)。疾病組單核巨噬細胞內(nèi)HDAC1，HDAC2，HDAC3和 HDAC4 mRNA的表達量相對于對照組的變化用以下公式計算：folds=2-△△CT，其中△△CT=△CT（實驗組）－△CT（對照組），△CT＝CT（目的基因）-CT（內(nèi)參基因），CT 值表示每個反應(yīng)管中的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，CT值越小，原始模板濃度越高，基因表達量越大。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.10統(tǒng)計軟件,采用Wilcoxon符號秩和檢驗及LSD方差分析；AD組HDAC3與IL-10、IL-12的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 AD患者外周血單核巨噬細胞I類HDAC家族分子表達的差異 AD患者外周血單核巨噬細胞中，I類HDAC家族分子之一的HDAC3的表達量與正常對照組相比明顯下降（P=0.026）。而HDAC I類家族的其他3個分子的表達量與對照組相比沒有明顯的變化。HDAC1，HDAC2和HDAC8的表達量與正常對照組相比較的P值分別為0.245，0.217和0.196。見圖 1。

2.2 外周血單核巨噬細胞中IL-10、IL-12的表達情況 AD患者外周血單核巨噬細胞中IL-10水平高于正常對照組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.029）。AD患者外周血單核巨噬細胞中IL-12水平雖低于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.105）。見圖 2。

2.3 AD患者外周血單核巨噬細胞HDAC3表達與IL-10、IL-12相關(guān)性分析 AD患者外周血單核巨噬細胞IL－10的表達與HDAC3的表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=-0.6522，與對照組相關(guān)系數(shù)相比，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.012）。AD患者外周血單核巨噬細胞IL-12與HDAC3的表達無直線相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為r=0.1436，與對照組相關(guān)系數(shù)相比，無明顯差別（P＝0.325）。

3 討論

AD的組織病理表現(xiàn)不具特征性,與刺激性皮炎或變應(yīng)性接觸性皮炎等其他皮膚病的病理表現(xiàn)相同。AD急性或早期的皮損特征為表皮海綿形成,散在的T淋巴細胞浸潤，LCs數(shù)目增加。AD皮損中大量存在的單核細胞說明單核細胞來源的巨噬細胞在AD皮膚炎癥的發(fā)生中起著重要作用，越來越受到廣泛的重視。

LCs利用淋巴結(jié)中與天然T細胞的相互作用影響T細胞細胞因子分泌模式的過程稱為“初”極化。LCs本身的表觀遺傳學(xué)變化而導(dǎo)致其本身極化過程是近來研究熱點[6]。以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎功能的巨噬細胞稱為M1型巨噬細胞。以使免疫反應(yīng)向Th2方向極化，能分泌IL-10、生長轉(zhuǎn)換因子（TGF-β）等的巨噬細胞稱為M2型巨噬細胞[7]。在AD中以M2型LCs為主。

HDAC是細胞內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一大類非常重要的表觀遺傳學(xué)分子。HDAC催化基因啟動子區(qū)域的組蛋白去乙?；?，從而改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，調(diào)節(jié)DNA與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體之間的結(jié)合，進而決定基因激活或者沉默[8]。

研究表明，HDAC在免疫細胞功能調(diào)控中的作用是近來研究的熱點。Grausenburger等[9]發(fā)現(xiàn)，HDAC1敲除的T淋巴細胞IL-4分泌增加，表現(xiàn)出明顯向Th2分化的傾向。將HDAC 1敲除的T淋巴細胞輸注小鼠體內(nèi)可以明顯增加小鼠氣道炎癥和高反應(yīng)性，抗感染和腫瘤能力減弱。進一步的研究揭示了HDAC1可以直接與IL-4啟動子區(qū)結(jié)合，直接調(diào)控IL-4的表達。HDAC在調(diào)節(jié)樹突狀細胞免疫功能分化方面也起著非常重要的作用。HDAC抑制劑可以抑制樹突狀細胞分泌促炎因子，增加抗炎因子的表達，降低了抗感染和抗腫瘤能力，但對自身免疫疾病有保護作用。

在本研究中，HDAC3在AD患者外周血單核巨噬細胞中低表達，同時發(fā)現(xiàn)HDAC3與單核巨噬細胞中IL-10的表達呈明顯的負相關(guān)，說明HDAC3在巨噬細胞中低表達與AD的發(fā)病有關(guān)。這與Wu等[10]的報道相似，他們認為HDACⅠ類家族抑制劑可以促進巨噬細胞向M2方向極化，而且促進巨噬細胞誘導(dǎo)更為強烈的Th2免疫反應(yīng)。其結(jié)果亦提示HDAC3與皮膚的變應(yīng)性疾病發(fā)病存在關(guān)聯(lián)。這為進一步研究表觀遺傳在AD發(fā)病中的機制奠定了基礎(chǔ)，有助于人們對這些疾病的預(yù)防和治療。

［1］The International Study of Asthma and Allergies in Childhood(ISAAC)Steering Committee.Worldwide variation in prevalence of symptoms of asthma,allergic rhino-conjunctivitis,and atopic eczema:ISAAC[J].Lancet,1998,351:1225-1232.[Noauthorslisted].

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