低產(chǎn)乙醛啤酒酵母的定向馴化篩選*

沈楠，王金晶，劉春鳳，李永仙，李崎

1(江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

2(江南大學(xué)釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇 無錫，214122)

乙醛，啤酒中含量最高的揮發(fā)性醛，是啤酒生青味、爛蘋果味的主要來源，其含量的高低直接決定了啤酒的品質(zhì)。成熟的優(yōu)質(zhì)啤酒的乙醛含量一般在3～8 mg/L［1］。乙醛是引起“上頭”的物質(zhì)之一，并具有致癌作用，國(guó)外學(xué)者對(duì)其致癌性和毒性已進(jìn)行了大量的研究［2］。因此，目前關(guān)于乙醛的研究重點(diǎn)是如何降低其在啤酒中的含量。

國(guó)內(nèi)外的啤酒生產(chǎn)一般都是通過釀造工藝的調(diào)整來降低乙醛的含量［3－6］。但要從根本上解決成品啤酒中乙醛含量偏高的問題，選育低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母是最理想的措施和手段。因此很多研究者利用分子手段通過基因工程的方法改良菌種來改變乙醛的代謝能力［7－10］，以達(dá)到降低乙醛產(chǎn)量的目的。

在酵母的代謝途徑中(如圖1)，乙醛脫氫酶是乙醛代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一。雙硫侖是乙醛脫氫酶的抑制劑，使乙醛不能氧化為乙酸，致使乙醛在胞內(nèi)蓄積，乙醛是毒性物質(zhì)，當(dāng)胞內(nèi)乙醛濃度升高時(shí)，可與一些蛋白質(zhì)、磷脂、核酸等形成共價(jià)鍵結(jié)合，導(dǎo)致這些物質(zhì)失活，從而引起機(jī)體的多種不適。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)雙硫侖的關(guān)注主要在醫(yī)藥領(lǐng)域，其作為戒酒、抗白內(nèi)障、抗膠質(zhì)瘤等藥物已被廣泛應(yīng)用，尚未有研究報(bào)道其可作為酵母選育的“篩子”。本文設(shè)想利用雙硫侖篩選低產(chǎn)乙醛酵母，其原理如下:在含有雙硫侖的、以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)上，雙硫侖通過抑制乙醛脫氫酶的活性而抑制酵母的生長(zhǎng)，然而酶活性相對(duì)較高的菌株由于乙醛脫氫酶活性只受到部分抑制因而能繼續(xù)在雙硫侖平板上生長(zhǎng)。能產(chǎn)高活性乙醛脫氫酶的菌株，其代謝的乙醛可在該酶的作用下被快速轉(zhuǎn)化，從而使乙醛含量降低，由此即可篩選出低產(chǎn)乙醛的啤酒酵母。

圖1 酵母乙醛代謝途徑［4］Fig.1 The metabolic pathways of acetaldehyde in yeast

考慮到既要加快乙醛的代謝速度又不能過多改變?cè)摼甑钠渌黜?xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，本研究決定采用紫外誘變的形式對(duì)酵母進(jìn)行改良，利用雙硫侖平板初篩到高乙醛脫氫酶的酵母，再將其置于高濃度乙醛培養(yǎng)基連續(xù)馴養(yǎng)，進(jìn)化出較強(qiáng)的乙醛代謝能力而篩選出優(yōu)選菌，從代謝途徑上降低酵母代謝乙醛的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養(yǎng)基

釀酒酵母(Saccharomyces pastorianu)MI4，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

無碳培養(yǎng)基:(NH4)2SO45 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，酵母膏0.1 g/L，滅菌條件:121 ℃，20 min。

雙硫侖平板:在無碳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加瓊脂、無水乙醇及一定濃度的雙硫侖。

乙醛培養(yǎng)基:(NH4)2SO45 g/L ，KH2PO41 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCl20.1 g/L，酵母膏0.1 g/L，乙醛500 mg/L，滅菌條件:121 ℃，20 min。

YEPD 培養(yǎng)基:酵母浸出粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 6.0，滅菌條件:115 ℃15 min。

自制麥汁:滅菌條件:115 ℃15 min。

1.1.2 試劑

酵母浸出粉，蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID;葡萄糖，無水乙醇，CaCl2，NaCl，(NH4)2SO4等，國(guó)藥集團(tuán);雙硫侖，鎮(zhèn)江天茂橡膠助劑有限公司;麥芽，中糧;99.5%乙醛，阿拉丁。

1.1.3 儀器

滅菌鍋，日本Hirayama-HVE-50;頂空氣相色譜儀(GC-2010 型)，日本島津(Shimadzu)公司;超凈臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司;生化培養(yǎng)箱SPX-250，上海躍進(jìn);HYG-A 全溫?fù)u瓶柜，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 紫外誘變［11］

將對(duì)數(shù)期的酵母培養(yǎng)液以3 000 r/min 離心5 min，傾去上清液，生理鹽水洗滌1 次，洗滌后用生理鹽水重懸稀釋，使重懸液中酵母細(xì)胞數(shù)達(dá)到106～107CFU/mL 左右。取上述菌懸液10 mL 于9 cm 培養(yǎng)皿，同時(shí)放入一無菌磁力攪拌器，置于磁力攪拌器上，置于已開啟預(yù)熱10 min 的15 W 紫外燈下30 cm 處。開啟皿蓋照射10 ～70 s 后，稀釋涂布于YPD 平板，在避光條件下于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.2 雙硫侖初篩

將預(yù)先用生理鹽水洗滌2 ～3 次的誘變菌涂布于含3.5 mg/L 的雙硫侖抗性平板上，培養(yǎng)4 ～5 d 后，挑取能生長(zhǎng)在此平板上生長(zhǎng)的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.3 高濃度乙醛培養(yǎng)基馴化

經(jīng)初篩后的酵母置于一定濃度的以乙醛為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，每48 ～72 h 轉(zhuǎn)接1 次以保證乙醛的濃度，11 ℃培養(yǎng)14 d。

1.2.4 搖瓶發(fā)酵

斜面菌株1 環(huán)→10 mL 試管(25 ℃，36 h)→9 mL試管(25 ℃，36 h)→70 mL 麥汁(23 ℃，48 h)→4 ℃冰箱中沉降酵母泥12 h 左右→250 mL 麥汁(500 mL錐形瓶中)，搖勻后上發(fā)酵栓，水或濃硫酸密封→11℃發(fā)酵6 d→分析乙醛含量

1.2.5 頂空氣相色譜法測(cè)定乙醛含量［12］

頂空進(jìn)樣器平衡溫度70 ℃，平衡時(shí)間30 min，傳輸線溫度:130 ℃，進(jìn)樣時(shí)間:0.04 min，進(jìn)樣口溫度:200 ℃，檢測(cè)器溫度:250 ℃，色譜柱初始溫度40 ℃，經(jīng)程序升溫10 ℃/min 到180 ℃;柱流量1. 2 mL/min，載氣(N2)流量:30 mL/min，燃?xì)?H2)流量:47 mL/min，助燃?xì)?空氣)流量:400 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 致死率曲線

使用15 W 紫外燈，在30 cm 處對(duì)打散的酵母菌液進(jìn)行不同時(shí)間的紫外照射，得到酵母的致死情況如圖2 所示。

圖2 不同照射時(shí)間下的酵母致死率Fig.2 Lethality of lager yeast strains after UV mutation

采用紫外誘變選育啤酒酵母一般要考慮以下幾方面，首先紫外致死率較低則達(dá)不到對(duì)啤酒酵母某些發(fā)酵性能進(jìn)行改良的目的，其次較高的致死率又會(huì)引起出發(fā)菌性能的大幅度改變，會(huì)改變成品啤酒的主體風(fēng)味，因此選擇80%的致死率為最佳，即選擇經(jīng)紫外誘變27 s 后的菌株進(jìn)行誘變。

2.2 雙硫侖初篩方法的建立

分別以含雙硫侖濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L 的培養(yǎng)基培養(yǎng)出發(fā)菌，只有雙硫侖為3.5 mg/L 的培養(yǎng)基無酵母長(zhǎng)出，所以選取3.5 mg/L為篩選低產(chǎn)乙醛酵母的抗性濃度。將經(jīng)生理鹽水洗滌后的誘變酵母菌株均勻涂于以乙醇為唯一碳源、雙硫侖含量為3.5 mg/L 的選擇培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 ～72 h 后，長(zhǎng)出乳白色菌落，如圖3 所示。

同時(shí)從上述雙硫侖抗性平板上挑取50 株生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌落，進(jìn)行500 mL 三角瓶發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后考察其乙醛含量，結(jié)果如表1 所示。實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)雙硫侖平板篩選的酵母均是乙醛含量降低的菌株，只是乙醛含量的降低幅度有高有低，需要進(jìn)一步篩選。

圖3 誘變菌初篩結(jié)果Fig.3 Screening of mutant strains

2.3 乙醛馴養(yǎng)可行性的驗(yàn)證

經(jīng)紫外誘變的酵母分別置于乙醛培養(yǎng)基(乙醛含量為150 mg/L)和普通的麥汁(原麥濃度為11 °P)培養(yǎng)中馴養(yǎng)同樣的時(shí)間后，進(jìn)行三角瓶發(fā)酵，考察其乙醛含量。由表2 和表3 可以看出，經(jīng)乙醛培養(yǎng)基馴養(yǎng)的酵母乙醛下降率(89.5%)要高于普通麥汁馴養(yǎng)的酵母(63.1%)。而且經(jīng)過乙醛培養(yǎng)基馴養(yǎng)的酵母乙醛含量下降50%以上的占68.4%，而經(jīng)麥汁培養(yǎng)馴養(yǎng)的乙醛下降50%僅占15%。從而證明酵母通過一定時(shí)間的高濃度的乙醛壓力的馴化，提高酵母自身轉(zhuǎn)化乙醛的能力，使終產(chǎn)物中乙醛的濃度進(jìn)一步降低。雙硫侖平板與乙醛培養(yǎng)基馴化的結(jié)合可以有效的篩選出低產(chǎn)乙醛酵母菌，減少了菌株選育的盲目性。

表2 經(jīng)乙醛培養(yǎng)基馴養(yǎng)后的酵母發(fā)酵情況Table 2 Fermentation of the yeast by directional domestication with acetaldehyde

表3 經(jīng)普通麥汁培養(yǎng)基馴養(yǎng)后的酵母發(fā)酵情況Table 3 Fermentation of the yeast by directional domestication with wort

2.4 菌種的篩選

2.4.1 初篩

挑取雙硫侖抗性平板上的單菌落經(jīng)活化后，接入帶有發(fā)酵栓的500 mL 三角瓶進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液中的乙醛進(jìn)行分析，部分結(jié)果如表4 所示。

2.4.2 復(fù)篩

從初篩的60 株酵母中選出4 株較優(yōu)的進(jìn)一步復(fù)篩，將4 株菌在乙醛含量為150 mg/L 的液體培養(yǎng)基中11 ℃?zhèn)鞔L(zhǎng)，低溫既符合啤酒工業(yè)生產(chǎn)的發(fā)酵環(huán)境也保證乙醛的不揮發(fā)，同時(shí)每48 h 轉(zhuǎn)接1 次新鮮的乙醛培養(yǎng)基，使菌體始終處在“高滲透壓”的環(huán)境下，利于其定向馴化。4 株啤酒酵母經(jīng)復(fù)篩后，搖瓶發(fā)酵乙醛含量如表5 所示。

表5 4 株優(yōu)選菌發(fā)酵液乙醛含量Table 5 Acetaldehyde content of four mutants

表5 中4 株啤酒酵母的乙醛含量均可適用于啤酒生產(chǎn)，但是考察1 株啤酒酵母，要綜合多種發(fā)酵性能，以保證其可以滿足啤酒實(shí)際大生產(chǎn)的需要。綜合啤酒風(fēng)味、酵母的生長(zhǎng)性能、遺傳穩(wěn)定性等生理生化指標(biāo)，最終發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明D-A-14 更符合啤酒生產(chǎn)的要求，如表6 所示D-A-14 發(fā)酵液相對(duì)于出發(fā)菌MI4而言，高級(jí)醇總量降低而酯升高，風(fēng)味更加協(xié)調(diào)。同時(shí)通過對(duì)該株菌的大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該株適合在15 ℃發(fā)酵，相對(duì)于傳統(tǒng)的11 ℃的低溫發(fā)酵，更有利于節(jié)能降耗。

表6 出發(fā)菌與優(yōu)選菌的三角瓶發(fā)酵指標(biāo)(mg/L)Table 6 Some indexes with the fermentation of initial strain and mutants (mg/L)

3 結(jié)論

采用紫外誘變的處理方式，再經(jīng)雙硫侖平板初篩及乙醛液體培養(yǎng)基復(fù)篩可以有效的得到低產(chǎn)乙醛啤酒酵母，該菌株各項(xiàng)發(fā)酵性能良好，遺傳性能穩(wěn)定，適用于啤酒工業(yè)大生產(chǎn)。

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