玫瑰果多酚的提取

劉鵬莉，莊桂東，王珊珊，于丹，李群飛，遲玉森

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島，266109)

玫瑰果也稱作薔薇果，是玫瑰花謝后由花托發(fā)育而成的肉質(zhì)漿果?！吨兴幋筠o典》中記載:玫瑰果具有健脾消食，活血調(diào)經(jīng)，斂肺止咳等作用［1］。新近研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰果還具有抗衰老、抗疲勞、抗輻射、耐缺氧、除血栓、降血壓、防癌、治癌、強(qiáng)身壯陽、健腦增智、延年益壽的作用［2－3］。

植物多酚又稱單寧或鞣質(zhì)，廣泛存在于蔬菜、水果及茶等植物中，具有抗氧化、抗癌、降血壓和預(yù)防心腦血管疾病等作用。［4］

本實(shí)驗(yàn)采用溶劑法提取玫瑰果中多酚類物質(zhì)，通過單因素和正交試驗(yàn)篩選，確定提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

玫瑰果，青島農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植。

1.1.2 試劑

沒食子酸對照品，中國藥品生物制品檢定所;Na2CO3，95%乙醇，福林酚，均為分析純。

1.1.3 儀器

1 000～5 000 μL移液槍，DRAGON;TU－1810S型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;RE－52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;AR1140電子分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司;SX－7001D電子天平，順德拓普域電子有限公司;102型電熱鼓風(fēng)干燥箱，中國龍口市先科儀器公司;雙列四孔電熱恒溫水浴鍋，中國龍口市先科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玫瑰果處理方法

將凋謝的玫瑰花花托去除殘余花瓣、花萼、花蕊及花柄，留曲玫瑰果實(shí)。

1.2.1 玫瑰果干物質(zhì)含量測定

定量稱取10 g玫瑰果，放入干燥箱中90℃干燥至前后兩次稱量總重變化小于0.02 g。真空冷卻，稱量干燥后的玫瑰果質(zhì)量，計算玫瑰果干物質(zhì)含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［5］

1.2.2.1 試劑配制

10%福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑:將20 mL福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑轉(zhuǎn)移到200 mL容量瓶中，用水定容并搖勻。

75 g/L NaCO3溶液配制:稱取37.50 g±0.01 g NaCO3，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻。

1.2.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取0.110 g±0.001 g沒食子酸，加水溶解并定容至100 mL，搖勻，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液(1 000 μg/mL)。用移液槍分別移取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL容量瓶中，分別用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得沒食子酸工作液，質(zhì)量濃度分別為 10、20、30、40、50 μg/mL。

用移液槍分別移取沒食子酸工作液各1.0 mL于10 mL容量瓶中，向容量瓶中分別加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，靜置2～3 min，再加入4 mL 75 g/L NaCO3溶液，搖勻，靜置60 min。同時做空白。

用10 mL比色皿進(jìn)行光譜掃描，確定770 nm處為最大吸收波長。在770 nm波長條件下，用分光光度計測定沒食子酸工作液的吸光度(A)。以吸光度A為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度c(μg/mL)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。建立回歸方程如下:

1.2.3 玫瑰果多酚的提?。?－7］

定量稱取10 g玫瑰果果肉，粉碎，加入提取劑，在一定溫度條件下提取一定時間，將提取液過濾，既得玫瑰果多酚提取液。取少量提取液用于多酚含量測定，剩余提取液真空濃縮至質(zhì)量恒定，既得多酚粗提物。

1.2.4 總酚的測定［21］

取1 mL待測液至50 mL容量瓶中，定容至刻度。取1 mL定容后的溶液于10 mL容量瓶中，加入5 mL 10%福林酚試劑，搖勻，靜置2～3 min，再加入4 mL 75 g/L NaCO3溶液，搖勻，靜置60 min。同樣條件下以蒸餾水設(shè)置空白對照。用10 mL比色皿在770 nm下測定吸光度，并計算多酚得率。

A，樣品吸光度;V，樣品提取液體積(mL);d，稀釋因子(通常為1 mL，稀釋成100 mL，則其稀釋因子為100)，50;SLOPEstd，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，0.0108;m，樣品干物質(zhì)含量(g);m0，樣品質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玫瑰果多酚提取單因素試驗(yàn)研究

2.1.1 提取劑對多酚提取效果的影響

由于乙醇安全無毒、廉價易得、回收率高，本實(shí)驗(yàn)只選用乙醇與水2種試劑作為提取劑。

定量稱取10 g玫瑰果果肉2份，粉碎，分別加入20倍量(mL/g)的無水乙醇、水，置于70℃水浴中提取40 min。結(jié)果如圖1所示。

從學(xué)生認(rèn)為這門課程需要改進(jìn)的方面來看，在學(xué)習(xí)資源方面，學(xué)生希望增加英語歌曲、視頻等多媒體資源。在學(xué)習(xí)內(nèi)容方面，學(xué)生希望能更多地接觸到與日常生活密切相關(guān)的話題。

由圖1可以看出，用無水乙醇做提取劑時，多酚得率較高。并且，由于水中易溶解氧，當(dāng)用水作為提取劑提取多酚時，易造成多酚氧化，而氧氣在乙醇中溶解度較低，因此將乙醇選為提取劑。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取效果的影響

定量稱取10 g玫瑰果果肉5份，粉碎，分別加入20倍量(mL/g)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(55%、65%、75%、85%、95%)，置于 70℃ 水浴中提取 40 min。結(jié)果如圖2所示。

圖1 提取劑對多酚得率的影響Fig.1 Effect of solvent type on the yield of polyphenols

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，多酚得率最高?？赡苁怯捎诙喾宇愇镔|(zhì)以氫鍵與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合為穩(wěn)定的化合物，而有機(jī)溶劑能夠使氫鍵斷裂;同時，玫瑰果中多酚類物質(zhì)可能為水溶性物與脂溶性物的混合體，乙醇與水的混合體更利于多酚的溶解。因此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%。

2.1.3 料液比對多酚提取效果的影響

定量稱取10 g玫瑰果果肉5份，粉碎，分別加入10、15、20、25、30 倍量(mL/g)體積分?jǐn)?shù)為 75% 的乙醇溶液，置于70℃水浴中提取40 min。結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著料液比的減小，多酚得率增加，當(dāng)料液比小于1∶20時，多酚得率略微降低。這說明當(dāng)料液比為1∶20時，提取劑已足夠?qū)⒚倒骞械亩喾尤芙?，同時考慮提取劑用量及濃縮時間，選取1∶20為提取料液比。

定量稱取10 g玫瑰果果肉5份，粉碎，加入20倍量(mL/g)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，分別置于40、50、60、70、80℃ 水浴中提取 40 min。結(jié)果如圖 4所示。

圖3 料液比對多酚得率的影響Fig.3 Effect of material/liquid ratio on the yield of polyphenols

圖4 提取溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols

由圖4可知，隨溫度升高，多酚得率增加，當(dāng)溫度超過60℃時，多酚得率又有所減少?？赡苁怯捎跍囟壬呤苟喾尤芙舛仍龃?，而過高溫度使多酚氧化造成損失。因此，選擇60℃為提取溫度。

2.1.5 提取時間對多酚提取效果的影響

定量稱取10 g玫瑰果果肉5份，粉碎，加入20倍量(mL/g)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，置于60℃水浴中分別提取 10、20、30、40、50 min。結(jié)果如圖 5所示。

由圖5可知，隨提取時間的延長，多酚得率增大，當(dāng)提取超過40 min時，多酚得率無明顯變化。因此，選擇40 min為提取時間。

2.1.6 提取次數(shù)對多酚提取效果的影響

定量稱取10 g玫瑰果果肉5份，粉碎，加入20倍量(mL/g)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，置于60℃水浴中提取40 min。分別提取 1、2、3、4、5 次。結(jié)果如圖6所示。

圖5 提取時間對多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polyphenols

圖6提取次數(shù)對多酚得率的影響Fig.6 Effect of extraction times on the yield of polyphenols

由圖6可知，提取3次時，多酚得率最高，但與提取2次相比，無明顯優(yōu)勢。而且，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到4次時，多酚得率反而有所下降，可能是由于長時間提取使多酚氧化損失。因此，可慮到生產(chǎn)成本，選擇2次為提取次數(shù)。

2.2 玫瑰果多酚提取優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗(yàn)，對乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度及提取時間進(jìn)行試驗(yàn)，確定優(yōu)化工藝參數(shù)。

由表1極差(R)分析可知，各因素對多酚提取率的影響次序?yàn)镈＞A＞C＞B，即乙醇體積分?jǐn)?shù)(D)為主要影響因素，其次為提取溫度(A)、料液比(C)、提取時間(B)，最佳提取工藝為D2A2C2B2。

由于得出的最佳工藝組合在正交試驗(yàn)中并沒有出現(xiàn)，需進(jìn)行補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。定量稱取10 g玫瑰果果肉，粉碎，按工藝組合D2A2C2B2進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，即加入20倍量(mL/g)體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液，置于70℃水浴中提取40 min，測定多酚得率為9.17%，大于正交試驗(yàn)結(jié)果中的最大值9.03，因此，確定最佳提取工藝為D2A2C2B2。

2.3 重復(fù)實(shí)驗(yàn)

利用正交試驗(yàn)得出的最佳提取工藝，定量稱取3份玫瑰果，按料液比1∶20加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，在70℃下提取40 min，重復(fù)提取2次。結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 1 Orthogonal array design arrangement and experimental results

表2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability verification for optimized extraction conditions

3 結(jié)論與討論

(1)實(shí)驗(yàn)采用乙醇法提取玫瑰果多酚，具有安全、環(huán)保、操作簡單的特點(diǎn)。

(2)實(shí)驗(yàn)采用新國標(biāo)法測定玫瑰果多酚得率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可信。

(3)正交試驗(yàn)確定了最佳提取工藝為:提取溫度70℃，提取時間40 min，料液比 1∶20(g∶mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)75%，提取次數(shù)2次。方差分析表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果影響顯著，提取溫度和料液比次之，提取時間影響不顯著。

(4)乙醇浸提法提取玫瑰果多酚得率達(dá)9%以上，這表明玫瑰果中多酚物質(zhì)含量較高，可以作為多酚的提取原料，為保健食品領(lǐng)域提供新的資源。

(5)玫瑰果多酚的提取溫度在單因素試驗(yàn)中的結(jié)論為60℃較好，但在正交試驗(yàn)中則70℃較好，這可能是由于單因素試驗(yàn)中提取次數(shù)選取為一次，提取液中多酚濃度大、與氧氣接觸的機(jī)會大，提取溫度超過60℃時，繼續(xù)升溫，多酚幾乎不再溶出，而過高的溫度使多酚氧化破壞;正交試驗(yàn)中提取次數(shù)選取為兩次，第二次提取液中多酚的濃度較小，升高溫度使多酚的溶解度及擴(kuò)散速度增大，利于其溶出，同時，提取液中多酚含量較少，不易與氧氣接觸，升溫造成的氧化損失少。因此，受提取次數(shù)的影響，最終通過正交試驗(yàn)確定的提取溫度為70℃。

［1］ 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典［M］.上海:科學(xué)技術(shù)出版社，2006.

［2］ 史鳳英，吳英俊，吳景時.牡丹江產(chǎn)野玫瑰果對血管藥理作用研究［J］.中國林副特產(chǎn)，2005(2):36.

［3］ 李明，李艷芳，孫永超.中藥玫瑰花的研究進(jìn)展［J］.衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25(8):146－148.

［4］ 石碧，狄瑩.植物多酚［M］.北京:科學(xué)出版社，2000.

［5］ GB/T 8313－2008.茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法［S］.

［6］ 黃皓，毛志方，涂云飛等.兩種方法測定茶葉中茶多酚含量的比較［J］.中國茶葉加工，2009(2):43－44.

［7］ 汪躍華，孟祥春，林銀鳳等.南山茶茶籽多酚的提取及測定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(1):118－119.