雙硫侖對結(jié)腸癌細胞SW480生長和侵襲的作用及機制研究

紀 猛，張媛媛，汪瑞辰

江蘇省腫瘤醫(yī)院，江蘇省腫瘤防治研究所，南京醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院，南京 210009

隨著生活水平的提高，人們的生活習慣和飲食方式發(fā)生了很大的改變，尤其是“紅肉”飲食的大量攝入[1，2]，使得我國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年增加，嚴重影響了人們的生存周期和生活質(zhì)量。結(jié)腸癌具有增殖速率快、能量代謝旺盛、易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的特點[3，4]，因而對于開發(fā)能夠抑制結(jié)腸癌細胞增殖、生長和轉(zhuǎn)移的藥物顯得極為緊迫。經(jīng)典的結(jié)腸癌治療藥物的研發(fā)從化合物的篩選到成藥需要數(shù)十年時間和數(shù)億元的經(jīng)費投入，嚴重限制了結(jié)腸癌的有效治療，因而從臨床常用的經(jīng)典藥物入手，“老藥新用”的研發(fā)方式為藥學專家所關(guān)注。雙硫侖（disulfiram）[5]是一種常用的廉價戒酒藥物，因其能夠不可逆地抑制胞質(zhì)內(nèi)和線粒體內(nèi)的乙醛脫氫酶，使嗜酒者轉(zhuǎn)而對飲酒產(chǎn)生厭惡和恐懼心理，從而放棄酗酒而達到戒酒目的。同時毒理學研究表明，單獨使用雙硫侖對機體不產(chǎn)生毒性作用，更可貴的是，研究表明，雙硫侖具有潛在的抗腫瘤潛力[6，7]且具體機制不清。因而，本研究通過體內(nèi)體外細胞和移植瘤實驗考察雙硫侖的抗結(jié)腸癌作用，并通過低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白 1（Glucose transporter 1，GLUT1）信號通路[8，9]對其潛在的抗腫瘤作用機制進行研究，以期為后續(xù)的實驗及臨床研究提供參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

雙硫侖 （批號S826357，Selleck公司）；順鉑（Cisplatin，批號 S117264，Selleck 公司）；MTS 試劑盒（Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit，Biovision公司）；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Matrigel基底膜基質(zhì)（批號6235007，美國BD公司）；HIF-1α和GLUT1單克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠SP檢測試劑盒（索萊寶公司）；其余試劑為化學純，均購自國藥化學有限公司；純化水（自制）。

1.2 細胞株

人結(jié)腸癌SW480細胞株，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.3 動物

BALB/c裸小鼠18只，體重18～22 g，均為雄性，由揚州大學比較醫(yī)學中心提供，動物合格證編號：201810315，動物許可證號：SCXK（蘇）2017-0007。動物自由飲水飲食，光照/黑暗時間12 h/12 h，環(huán)境溫度22℃～24℃，相對濕度50%～70%。

1.4 實驗儀器

電子天平（型號BSA224S-CW，Sartorius科學儀器廠）；二氧化碳培養(yǎng)箱（型號3110，美國Thermo公司）；多功能酶標儀（型號GM3500，美國Promega公司）；純水儀（型號TANKPE060，美國Millipore公司）。

2 方 法

2.1 雙硫侖對SW480細胞增殖的影響

采用MTS法對細胞增殖能力進行檢測。采用0.25%胰酶對SW480細胞進行消化后，每孔接種5×103個細胞于96孔板中（100μL）。細胞貼壁后，吸去舊培養(yǎng)基，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實驗共分7個組，每組6個平行孔。各組雙硫侖濃度分別為0、2、4、8、16、32、64 μmol·L-1或順鉑濃度分別為 0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1。 藥物分別處理 24 h或48 h后每孔加入20 μL MTS，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2h后于酶標儀490nm波長處檢測其吸光度值。

2.2 雙硫侖對SW480細胞遷移的影響

采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。細胞消化后，每孔接種3×105個SW480細胞于6孔板中（2 mL）。細胞貼壁后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去上清液，無菌PBS清洗細胞兩次后，用白色的10 μL槍頭沿每孔的中線垂直劃痕。然后無菌PBS繼續(xù)清洗兩次，加入100 μL的新鮮含藥培養(yǎng)基。實驗共分4組，分別為：對照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1、8 μmol·L-1。每組設(shè)置 3 個平行孔。24 h后分別于100倍顯微鏡下拍照。細胞遷移率（%）=（1-24 h劃痕寬度/0 h時間點劃痕寬度）×100%。

2.3 雙硫侖對SW480細胞侵襲的影響

采用Transwell實驗檢測細胞的侵襲能力。于Transwell小室上室的膜表面均勻鋪被含Matrigel（去生長因子）的 DMEM培養(yǎng)基稀釋液（1∶4，體積比），置培養(yǎng)箱中稍微受熱使其凝固。將5×103個SW480細胞接種在Transwell小室的上室，同時于上室加入100 μL含藥培養(yǎng)基。實驗共分4組，分別為：對照組、順鉑組和雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1組，各組分別加入 PBS、順鉑 2.5 μmol·L-1、雙硫侖 4 μmol·L-1組、8 μmol·L-1。每組設(shè)置 3 個平行孔。Transwell下室加入 600 μL含 20%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥物處理結(jié)束后，用棉簽小心將上室中沒有遷移的細胞拭去，將上室底部的膜取下，并按下述操作處理：用4%多聚甲醛固定10 min→PBS洗滌→0.1%結(jié)晶紫染色30 min→PBS漂洗3次→置載玻片上→200×鏡下隨機選5個視野進行拍照計數(shù)后、計算每個視野的平均值。

2.4 雙硫侖對SW480荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響

SW480細胞經(jīng)大量培養(yǎng)后，胰酶消化后DMEM培養(yǎng)基重懸細胞并計數(shù)。采用DMEM培養(yǎng)基將細胞濃度調(diào)至2×107/mL，后加入等體積的Matrigel膠混合均勻，調(diào)整細胞終濃度為1×107/mL。于Balb/c裸鼠右下肢皮下接種細胞懸液，每只接種體積為0.2mL。觀察腫瘤體積，待瘤塊直徑達0.5～1.0cm時，將裸鼠隨機分為3組，每組6只，分別為模型組、雙硫侖20mg·L-1組、40mg·L-1組。 采用灌胃給予相應的雙硫侖或生理鹽水，給藥體積為0.4 mL/20 g體重，實驗共21 d。用游標卡尺每3天測量各組裸鼠瘤體積，實驗結(jié)束后，處死裸鼠，取出瘤組織，進行拍照并稱重，腫瘤組織以4%的多聚甲醛固定以進行后續(xù)免疫組化實驗。腫瘤體積計算方法：V=A×B2×0.5，其中A為腫瘤最長直徑，B為腫瘤最短直徑。

2.5 雙硫侖對SW480荷瘤裸鼠腫瘤組織中HIF-1α和GLUT1蛋白表達的影響

采用免疫組化法檢測腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1蛋白表達水平。將固定后的腫瘤組織進行常規(guī)石蠟包埋及切片，6μm厚度為宜，切片經(jīng)脫蠟水化，先經(jīng)過氧化物阻斷、非免疫性動物血清保護后，加入HIF-1α和GLUT1一抗（1∶200進行稀釋）孵育過夜，清洗封閉后，加入生物素標記的二抗孵育、鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶等步驟，進行DAB顯色，蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。晾干后顯微鏡400倍進行拍照。采用Image J軟件統(tǒng)計HIF-1α和GLUT1蛋白的光密度值，計算平均光密度。平均光密度值=累計光密度/面積。

2.6 統(tǒng)計方法

實驗結(jié)果采用Graph Pad Prism 5軟件進行作圖分析，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），Student-Newman-Keuls post hoc檢驗進行組間比較。P＜0.05為具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 雙硫侖對SW480結(jié)腸癌細胞增殖具有抑制作用

采用不同濃度的雙硫侖分別處理SW480結(jié)腸癌細胞24 h和48 h，MTS結(jié)果顯示，雙硫侖16、32、64 μmol·L-1濃度時可以抑制腫瘤細胞的增殖，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應關(guān)系，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。雙硫侖處理結(jié)腸癌細胞24 h和48h 的 IC50分別為 42.12μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1（見圖1）。同時，順鉑處理結(jié)腸癌細胞24h和48h的IC50分別為 16.62μmol·L-1和 15.20μmol·L-1。實驗表明，雙硫侖能夠明顯抑制SW480結(jié)腸癌細胞的增殖。

3.2 雙硫侖抑制SW480結(jié)腸癌細胞的遷移

選取了對細胞增殖無顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1、8μmol·L-1濃度和順鉑 2.5μmol·L-1處理細胞 24h，研究雙硫侖對SW480結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響。結(jié)果顯示，雙硫侖處理細胞 24 h 后，4 μmol·L-1組和8 μmol·L-1組均能夠抑制 SW480結(jié)腸癌細胞的體外遷移，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義 （P<0.05）。結(jié)果表明，雙硫侖能夠抑制SW480結(jié)腸癌細胞的遷移（見圖2）。

圖1 雙硫侖對結(jié)腸癌細胞SW480增殖的影響（x±s，n=6）

圖2 雙硫侖對SW480結(jié)腸癌腫瘤細胞遷移能力的影響（x±s，n=3）

3.3 雙硫侖抑制SW480結(jié)腸癌細胞的侵襲

選取了對細胞增殖無顯著影響的雙硫侖4μmol·L-1和 8 μmol·L-1濃度，處理細胞 24 h，研究雙硫侖對SW480結(jié)腸癌細胞侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，雙硫侖 4μmol·L-1組和 8μmol·L-1組均抑制 SW480結(jié)腸癌細胞的侵襲，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，表明雙硫侖能夠抑制SW480結(jié)腸癌細胞的侵襲（見圖 3）。

圖3 雙硫侖對SW480細胞侵襲的影響（x±s，n=3）

3.4 雙硫侖對裸鼠移植瘤的抑制作用

裸鼠皮下移植瘤實驗結(jié)果顯示，雙硫侖20 mg·kg-1組和40 mg·kg-1組均能減少SW480裸鼠皮下移植瘤的體積和瘤重，且與模型組相比具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)果表明，雙硫侖能夠抑制SW480裸鼠皮下移植瘤的體內(nèi)生長（見圖4）。

3.5 雙硫侖對GLUT1、HIF-1α因子表達的影響

結(jié)腸癌細胞體內(nèi)生長極為迅速，因此伴隨著HIF-1α高表達，同時HIF-1α能夠促進結(jié)腸癌組織GLUT1表達增加，以促進腫瘤糖攝取和能量代謝[9]，因此采用免疫組化檢測腫瘤組織中的HIF-1α和GLUT1表達水平。結(jié)果顯示，在裸鼠移植瘤組織中，雙硫侖 20 mg·kg-1和 40 mg·kg-1均能夠降低 HIF-1α和GLUT1的蛋白表達。實驗結(jié)果表明，雙硫侖可能通過下調(diào)HIF-1α和GLUT1蛋白的表達，起到抑制腫瘤生長的作用（見圖5）。

圖4 雙硫侖對SW480細胞裸鼠皮下移植瘤的體內(nèi)生長的影響，n=6）

4 討 論

雙硫侖是一種臨床廣泛使用的戒酒藥物，鑒于其具有安全無毒且潛在的抗腫瘤作用，使得對于研究雙硫侖的抗結(jié)腸癌作用及揭示其作用機制、開發(fā)新的抗結(jié)腸癌化療藥物具有重要的意義。殷文靜等[10]研究發(fā)現(xiàn)，采用雙硫侖單用或者聯(lián)合順鉑共用，均具有促進宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用，表明雙硫侖具有潛在的抗癌價值。因此本研究對雙硫侖抗結(jié)腸癌的作用及機制進行初步探索，并采用順鉑作為陽性藥進行比較。

圖5 雙硫侖對SW480細胞裸鼠皮下移植瘤HIF-1α、GLUT1的影響（x±s，n=6）

本研究表明，單獨使用雙硫侖能夠明顯抑制體外SW480結(jié)腸癌細胞和體內(nèi)移植瘤的增殖和生長，24 h 和 48 h 的 IC50分別為 42.12 μmol·L-1和 33.77 μmol·L-1，同時雙硫侖能夠抑制SW480細胞體外遷移和侵襲能力，其抑制作用與順鉑相近。鑒于結(jié)腸癌具有增殖迅速、能量代謝旺盛等特點，因而選取了缺氧誘導因子HIF-1[11]和葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1[12]對雙硫侖抑制SW480細胞惡性生物學行為的機制進行探討。研究已表明，腫瘤細胞最主要的特征是失控性生長，急劇生長的腫瘤細胞對于氧和糖的需求極其旺盛，為了維持其自身生長和增殖，則會調(diào)控一系列分子生物學反應來維持對氧和糖的獲取。HIF-1是一種腫瘤組織細胞適應缺氧環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)控因子，能在缺氧狀態(tài)下維持細胞氧的穩(wěn)態(tài)。同時，腫瘤細胞也能夠通過HIF-1促進下游的GLUT1蛋白表達，增加腫瘤細胞葡萄糖的攝入，維持其能量代謝水平，進而促進增殖、生長、遷移和侵襲。因而開展腫瘤細胞和組織中的HIF-1和GLUT1蛋白表達的研究，對于揭示雙硫侖抗腫瘤的作用顯得尤為重要。免疫組化結(jié)果表明，模型組結(jié)腸癌移植瘤組織中HIF-1和GLUT1蛋白水平相對較高，這與文獻報道一致[12]，而給予雙硫侖治療后移植瘤中的HIF-1和GLUT1蛋白水平明顯降低，表明雙硫侖可能通過抑制結(jié)腸癌細胞內(nèi)HIF-1和GLUT1蛋白水平，調(diào)控細胞能量代謝，從而起到抗結(jié)腸癌的作用。

綜上所述，雙硫侖能夠抑制結(jié)腸癌細胞的增殖、生長、遷移和侵襲，并發(fā)現(xiàn)其作用機制可能與抑制腫瘤細胞HIF-1和GLUT-1蛋白表達水平、調(diào)控能量代謝有關(guān)，這也提示下一步實驗將采用基因敲除等方式來研究雙硫侖抗結(jié)腸癌的作用機制。本研究表明，雙硫侖是一個具有潛在研究價值的抗腫瘤藥物，具有較好的研發(fā)前景。