結(jié)締組織生長因子基因RNA干擾復(fù)制缺陷型腺病毒載體的構(gòu)建及鑒定

郝春秋，彭梅娟，謝玉梅，周云，魏欣，馬力，王素娜，李瑞娟，張巖，白雪帆，賈戰(zhàn)生

第四軍醫(yī)大學(xué) 唐都醫(yī)院感染病診療中心，陜西 西安 710038

腺病毒具有宿主范圍廣、感染率高、包裝容量大、繁殖滴度高、安全性好、性質(zhì)穩(wěn)定、載體制備較容易等特點(diǎn)[1]，已成為應(yīng)用最廣泛的載體系統(tǒng)之一。結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）是重要的促組織纖維化蛋白，與肝、肺、腎等許多器官的纖維化密切相關(guān)[2]，是促進(jìn)膠原沉積致肝纖維化的主要細(xì)胞因子。RNA干擾（RNA interfer?ence，RNAi）可以在轉(zhuǎn)錄后水平阻斷基因表達(dá)，使靶基因沉默，是研究特定基因功能的可靠技術(shù)[3]。我們試圖利用RNAi原理，構(gòu)建能介導(dǎo)CTGF基因沉默的復(fù)制缺陷型腺病毒載體，為肝纖維化的防治提供一個有用的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒載體系統(tǒng)（穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1、骨架質(zhì)粒pAdEasy-1及包裝細(xì)胞AD-293）由德國學(xué)者Reske教授惠贈；大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自ATCC；大腸桿菌BJ-5183和DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及Plasmid Purifica?tion Kit均為Promega公司產(chǎn)品；脂質(zhì)體Lipo?fectAMINE2000、DMEM、RPMI1640及胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品；抗CTGF單克隆抗體、抗β-actin抗體購自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 靶向CTGF短發(fā)夾RNA的設(shè)計(jì)

根據(jù)小干擾 RNA（siRNA）設(shè)計(jì)原則[4-5]，參考GenBank公布的大鼠 CTGF（NM-022266）核苷酸序列，利用Ambion公司在線（http://www.ambion.com）設(shè)計(jì)工具，設(shè)計(jì)4對針對CTGF基因的siRNA序列（TS1～TS4）和1對無關(guān)陰性對照序列（TS5），并進(jìn)行BLAST同源性分析，保證序列的惟一性。為方便克隆與鑒定，在其5'和3'端分別引入BglⅡ和HindⅢ酶切位點(diǎn)，反義片段以后接終止信號TTTTTT以終止轉(zhuǎn)錄，形成BglⅡ酶切位點(diǎn)+19nt正義靶序列+9nt loop接頭序列+19nt反義靶序列+終止信號+HindⅢ酶切位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)（寡核苷酸由上海吉凱基因技術(shù)有限公司合成）。見表1。

1.3 腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的構(gòu)建及鑒定

將合成的單鏈寡核苷酸退火形成雙鏈DNA并檢測無誤。用HindⅢ、BglⅡ雙酶切穿梭質(zhì)粒pShut?tle-H1（圖1），酶切產(chǎn)物純化后，用T4噬菌體DNA連接酶于16℃連接線性化的pShuttle-H1及退火后的雙鏈DNA 12 h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌，在卡那霉素抗性LB平板上于37℃培養(yǎng)過夜，篩選擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的陽性菌落，提取質(zhì)粒并純化后獲得腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF，用EcoRⅠ酶切鑒定，并將酶切后獲得的小片段回收進(jìn)行測序分析。

1.4 復(fù)制缺陷型腺病毒載體Ad.H1-CTGF的包裝和滴定

培養(yǎng)腺病毒包裝細(xì)胞AD-293，達(dá)80%～90%匯合時加入1 μg鑒定無誤的腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shut?tle-CTGF 與 4 μg 骨 架 質(zhì) 粒 pAdEasy-1，用 Lipo?fectAMINE2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，使之進(jìn)行同源重組，第2 d傳代；轉(zhuǎn)染7～10 d后，75%～80%的細(xì)胞出現(xiàn)CPE時收集細(xì)胞，-80℃和37℃反復(fù)凍融3次釋毒，離心凍融液收集上清，即為第一代腺病毒載體Ad.H1-CTGF毒種，作為隨后大量病毒擴(kuò)增的原液，3次擴(kuò)增后獲得病毒保存液。同法獲得無關(guān)陰性對照病毒Ad.H1-Con原液及保存液，均于-80℃保存。病毒滴定采用TCID50法，即將病毒原液梯度稀釋至1/10-6～1/10-12，分別接種生長于96孔培養(yǎng)皿中的AD-293細(xì)胞，37℃培養(yǎng)72 h，用X-gal染色，計(jì)算病毒滴度。

1.5 空斑實(shí)驗(yàn)檢測腺病毒載體的感染性

將肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞低密度鋪于6孔板中，培養(yǎng)1 d后達(dá)60%～70%融合，用感染復(fù)數(shù)（MOI）為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細(xì)胞，未感染病毒的細(xì)胞為對照，加甲基纖維素覆蓋液后37℃培養(yǎng)7 d，吸除覆蓋液加結(jié)晶紫染色，清洗后觀察空斑形成情況。

1.6 Western印跡檢測病毒載體對CTGF基因的沉默效果

圖1 腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1圖譜及構(gòu)建示意圖

表1 編碼siRNA的DNA雙鏈

HSC-T6細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)1 d達(dá)60%～70%融合后，用MOI為100的腺病毒載體Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染細(xì)胞，37℃培養(yǎng)48 h后裂解細(xì)胞、提取蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE，然后將蛋白條帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，以抗CTGF單克隆抗體為一抗（1∶10）、山羊抗鼠IgG-HRP抗體為二抗（1∶100）進(jìn)行 Western印跡，檢測腺病毒載體對CTGF基因的沉默效果。

2 結(jié)果

2.1 含靶序列的單鏈寡核苷酸退火產(chǎn)物檢測

將合成的4對含靶序列、1對陰性對照序列的單鏈寡核苷酸于90℃溫育4 min、70℃溫育10 min，緩慢冷卻至室溫進(jìn)行退火，用12%非變性PAGE檢測退火形成雙鏈DNA的效率，均達(dá)90%以上（圖2），提示退火產(chǎn)物合格，可用來構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒。

2.2 腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的鑒定

由腺病毒穿梭質(zhì)粒pShuttle-H1圖譜（圖1）可看出，MCS中含有2個EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，EcoRⅠ酶切后形成2個片段，大片段6600 bp，小片段為300 bp的H1啟動子序列。在BglⅡ和HindⅢ位點(diǎn)間插入合成的寡核苷酸靶序列后，小片段長度則變?yōu)?60 bp。電泳結(jié)果（圖3）顯示，陰性對照質(zhì)粒p-shut?tle-H1酶切小片段為300 bp，陽性克隆質(zhì)粒p-shut?tle-CTGF酶切小片段為360 bp，大片段均為6600 bp，初步證明重組腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確。回收360 bp小片段進(jìn)行測序，證實(shí)序列完全正確（基因序列略）。

圖2 退火產(chǎn)物電泳圖譜

圖3 重組腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF的酶切鑒定

2.3 腺病毒載體的滴定和感染性鑒定

采用TCID50法對病毒進(jìn)行滴定，測出病毒保存液滴度為4×1010PFU/mL。用MOI為100的目標(biāo)病毒Ad.H1-CTGF和陰性對照病毒Ad.H1-Con感染HSC-T6細(xì)胞，7 d后目標(biāo)病毒Ad.H1-CTGF組和陰性對照病毒組Ad.H1-Con均有大量空斑形成，未感染病毒的HSC-T6細(xì)胞未見空斑形成，說明構(gòu)建的目標(biāo)病毒和陰性無關(guān)對照病毒均具有較好的感染性（圖4）。

2.4 腺病毒載體對CTGF基因沉默效果的Western印跡鑒定

Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，內(nèi)參照蛋白β-actin的表達(dá)水平在6組之間無明顯差異；而CTGF蛋白表達(dá)在包裝的4組目標(biāo)病毒感染HSC-T6細(xì)胞后均有不同程度降低，其中含靶序列TS3的病毒感染組降低最顯著；無關(guān)序列陰性對照病毒感染組CTGF蛋白表達(dá)與未感染細(xì)胞組一樣，未見降低（圖5）。提示構(gòu)建的含TS3靶序列的腺病毒載體具有較好的沉默CTGF基因的效果，將其命名為Ad.H1-CTGF，可作為以后抗纖維化研究的工具。

3 討論

我國是肝病大國，隨著慢性肝病病程的延續(xù)，其纖維化的進(jìn)程也一直持續(xù)，由于目前缺乏行之有效的根治辦法，這些人都面臨著肝硬化的潛在威脅，這已成了嚴(yán)峻的社會問題。因此，尋找有效的抗纖維化方法，阻止慢性肝病患者的肝硬化趨勢，已成為我國乃至全球亟待解決的問題。

圖4 包裝的腺病毒感染滴定

圖5 各組病毒對CTGF表達(dá)的影響

肝纖維化的成因，普遍認(rèn)為與肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化有關(guān)[6]，轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是目前公認(rèn)的致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子之一，其促纖維化作用主要是通過誘導(dǎo)其下游因子CTGF的表達(dá)，活化HSC來完成。業(yè)已證明，CTGF與肝、肺、腎等器官的纖維化、皮膚瘢痕形成、創(chuàng)傷修復(fù)及動脈粥樣硬化密切相關(guān)[7]。由于CTGF的生物學(xué)效應(yīng)相對單一，主要介導(dǎo)TGF-β的促細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成等作用，因此，阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性，可能是一種更特異、更有效的防止肝纖維化的手段。

RNAi技術(shù)具有高效性和高特異性，作為關(guān)閉基因的新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用[8]。RNAi的產(chǎn)生需要向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入siRNA或在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA，前者是將體外合成的siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞，雖簡單，但導(dǎo)入的siRNA易降解，且以瞬時表達(dá)為主，目前已較少使用；后者通過表達(dá)siRNA的質(zhì)?；虿《据d體在靶細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA，發(fā)揮RNAi作用，因方便、穩(wěn)定和高效而成為主流方法。腺病毒載體可以直接、高效、穩(wěn)定地感染細(xì)胞，避免了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的不便，逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-13]。

我們根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則[4-5]，設(shè)計(jì)了4對針對CTGF基因的siRNA序列和1對無關(guān)陰性對照序列，退火形成雙鏈DNA后定向克隆至pShuttle-H1的H1啟動子下游，獲得腺病毒穿梭質(zhì)粒p-shuttle-CTGF1-5，經(jīng)酶切、測序鑒定無誤后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1共轉(zhuǎn)染AD-293細(xì)胞，同源重組后獲得4株腺病毒載體和1株陰性對照病毒，空斑實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們均具有較好的感染性，Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)4組目標(biāo)病毒對HSC-T6細(xì)胞CTGF的表達(dá)均有不同程度的抑制，其中Ad.H1-CTGF3的抑制效果最好，抑制率達(dá)85%，達(dá)到了設(shè)計(jì)要求。該腺病毒載體的構(gòu)建成功，將為抗纖維化的研究提供可行的工具，為肝纖維化和肝硬化的防治奠定基礎(chǔ)。

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