齊口裂腹魚(yú)PGC-1α基因編碼區(qū)的克隆及其在肌肉組織中的表達(dá)

李瑞文 ，林亞秋 ，鄭玉才 ，張潤(rùn)鋒 ，宮佳琦 ，晁珊珊

1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都市第九人民醫(yī)院·成都市婦產(chǎn)科醫(yī)院 生殖與不孕研究所，四川 成都 610091；3.湖北師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃石 435002

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ co?activator-1α，PGC-1α）屬于與能量代謝關(guān)系最密切的PGC-1轉(zhuǎn)錄輔助活化因子家族，最早在酵母雙雜交體系中作為調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的核受體PPARγ的輔激活因子被發(fā)現(xiàn)[1]。PGC-1α主要在能量代謝旺盛或富含線粒體的組織如心臟、肝臟、肌肉、腦、腎和棕色脂肪中表達(dá)，具有明顯的組織特異性[2-3]。同時(shí)，寒冷、禁食、鍛煉和激素等因素刺激可誘導(dǎo)PGC-1α表達(dá)，然后與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，在不同組織和生物反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮其多種功能。因PGC-1α在機(jī)體諸多代謝過(guò)程，如肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化、線粒體生成、氧化代謝、適應(yīng)性產(chǎn)熱、葡萄糖代謝和肥胖及相關(guān)疾病治療[4-7]等中發(fā)揮重要作用，所以成為近年來(lái)備受關(guān)注的核受體轉(zhuǎn)錄輔助激活因子。關(guān)于PGC-1α的研究多集中于陸生動(dòng)物，在水生動(dòng)物中的研究報(bào)道較少[8-9]。有報(bào)道顯示，PGC-1α在魚(yú)類(lèi)和陸生動(dòng)物某些方面的調(diào)控作用存在差異，如線粒體生成和對(duì)溫度的敏感性方面[8-10]。因此，為了解析PGC-1α在魚(yú)類(lèi)和陸上動(dòng)物中存在的差異，需要首先闡明該基因在魚(yú)類(lèi)中的序列特征。

齊口裂腹魚(yú)是我國(guó)青藏高原特有的冷水性魚(yú)類(lèi)，屬鯉形目-鯉科-裂腹魚(yú)亞科-裂腹魚(yú)屬。其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，賴(lài)氨酸含量極為豐富，可作為賴(lài)氨酸的天然強(qiáng)化食品，在我國(guó)西部及東北地區(qū)的冷水養(yǎng)殖中具有很大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場(chǎng)養(yǎng)殖前景。我們以齊口裂腹魚(yú)肌肉組織為研究對(duì)象，通過(guò)克隆得到PGC-1α基因編碼區(qū)序列，檢測(cè)了其在基礎(chǔ)狀態(tài)和禁食狀態(tài)下在白肌和紅肌中的表達(dá)情況，為研究PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)肌肉中的調(diào)控作用提供了基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

齊口裂腹魚(yú)（500±12 g）購(gòu)自四川省雅安市蘆山養(yǎng)殖場(chǎng)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，在養(yǎng)殖單位為300 L的水族箱內(nèi)用海大牌鯉魚(yú)飼料飼養(yǎng)1周后開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水為曝氣后自來(lái)水（pH6.5），實(shí)驗(yàn)期間控制水溫為20±1℃，水體溶氧保持在5.0 mg/L以上。實(shí)驗(yàn)分2組，對(duì)照組飼喂商業(yè)飼料，實(shí)驗(yàn)組2周未飼喂任何飼料，2周后取對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組齊口裂腹魚(yú)的紅肌和白肌組織，置液氮內(nèi)備用。

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD-18T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq（2×）染料、Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自博大泰克公司。

1.2 齊口裂腹魚(yú)PGC-1α基因的克隆與序列分析

嚴(yán)格按照Invitrogen公司TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取齊口裂腹魚(yú)紅肌組織的總RNA，用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量。用1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0的方法，以 Oligo（dT）為引物合成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank中斑馬魚(yú)（Danio re?rio）PGC-1α 基 因 序 列（M_002667531，AY998087，F(xiàn)J710604，DQ017637），用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)PCR引物（包括完整的開(kāi)放讀框）F1（5'-GGATGGCGTGGGACAGGTGTAATC-3'）、R1（5'-GC TGGGGTGGTGCTGTCTCGTT-3）和 F2（5'-CTGAG CAAGGCGTCCTCCACTATG-3'）、R2（5'-TTACCTTC TCAGGCTGTACTGGG-3'），產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為 1343、1425 bp，克隆策略見(jiàn)圖1。25 μL PCR反應(yīng)體系包括超純水 16.375 μL、2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μL、PCR 緩沖液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、cDNA 1.5 μL、25 mol/L 引 物 各 0.5 μL、0.5 U/L Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR條件：94℃預(yù)變性5 min；95℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 1.5 min，38個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA回收試劑盒回收目的條帶，回收產(chǎn)物連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒并由上海英駿公司完成DNA測(cè)序。測(cè)序后采用NCBI的BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用在線軟件（http://www.marksgeneticsoftware.net/）確定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，用MEGA軟件制作物種進(jìn)化樹(shù)。

1.3 半定量RT-PCR檢測(cè)禁食狀態(tài)下的基因表達(dá)

圖1 齊口裂腹魚(yú)PGC-1α基因cDNA的克隆策略

參照1.2的方法提取對(duì)照組和禁食組齊口裂腹魚(yú)紅肌和白肌組織的總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用Primer Premier 5.0軟件根據(jù)齊口裂腹魚(yú)β-actin基因 序 列（JQ013000）和 所 獲 得 的 PGC-1α 序 列（JN195738）設(shè)計(jì)特異引物βF（GATTCGCTGGAGAT GATGCT）、βR（CGTTGTAGAAGGTGTGATGCC）（長(zhǎng)度為219 bp）和 PF（GCTGCCTTGGTTGGTGAA）、PR（CCTTGCCACCTGGGTATTG）（長(zhǎng)度為 439 bp），利用半定量RT-PCR檢測(cè)PGC-1α基因在紅肌和白肌中的表達(dá)情況。PGC-1α基因和β-actin基因PCR反應(yīng)體系同PGC-1α基因的克隆測(cè)序。PCR條件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56.8℃ 60 s/54.5℃ 60 s，72℃ 60 s，33個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Quantity one軟件分析。數(shù)據(jù)用PGC-1α與β-actin條帶的光密度比值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件分析所得數(shù)據(jù)，用x±s表示；采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)為差異顯著，P＜0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 齊口裂腹魚(yú)PGC-1α基因cDNA的克隆及序列分析

按照?qǐng)D1的克隆策略，采用RT-PCR方法對(duì)齊口裂腹魚(yú)紅肌中的PGC-1α基因進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得2條特異區(qū)帶，與預(yù)期片段大小一致（圖2）。獲得的特異擴(kuò)增序列經(jīng)膠回收和雙向測(cè)定后，拼接得到其cDNA序列2633 bp（GenBank登錄號(hào)為JN195738），其中開(kāi)放讀框（ORF）為2631 bp，編碼876個(gè)氨基酸殘基。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析表明，該序列包括MyOD、CREB和C/EBP等結(jié)合位點(diǎn)。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)N端含有LXXLL（142～146殘基）轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，C端含有一個(gè)RNA結(jié)合區(qū)域（755～822殘基）和富含絲氨酸/精氨酸的結(jié)構(gòu)域（SR結(jié)構(gòu)域）（646～677殘基）（圖3）。BLAST比對(duì)結(jié)果顯示齊口裂腹魚(yú)的PGC-1α氨基酸序列同GenBank登錄的人、小鼠、大鼠、牛、豬、雞、斑馬魚(yú)、草魚(yú)、虹鱒、金體美鳊、弓鰭魚(yú)、金魚(yú)和線翎電鰻的PGC-1α氨基酸序列的同源性為49%～93%，繪制的進(jìn)化樹(shù)見(jiàn)圖4。

圖2 齊口裂腹魚(yú)肌肉組織組織PGC-1α基因的RT-PCR結(jié)果

2.2 基礎(chǔ)狀態(tài)和禁食狀態(tài)下PGC-1α mRNA表達(dá)水平的變化

取對(duì)照組和禁食處理2周的實(shí)驗(yàn)組齊口裂腹魚(yú)的紅肌和白肌，用半定量RT-PCR檢測(cè)PGC-1α mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，PGC-1α在紅肌中的表達(dá)顯著高于白肌中（P＜0.05），與對(duì)照組相比，在禁食誘導(dǎo)2周的情況下，PGC-1α mRNA在紅肌和白肌中的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）（圖5）。這一結(jié)果證明通過(guò)禁食誘導(dǎo)可以顯著提高PGC-1α在肌肉中的表達(dá)水平。

3 討論

PGC-1家族包括PGC-1α、PGC-1β和PGC-1相關(guān)輔激活因子（PGC-1-related coactivator，PRC）等3個(gè)成員，是迄今與能量代謝關(guān)系最為密切的轉(zhuǎn)錄因子家族[2]，在許多脊椎動(dòng)物如靈長(zhǎng)類(lèi)、嚙齒動(dòng)物、反芻動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)、兩棲類(lèi)和魚(yú)類(lèi)中都存在[11]。但關(guān)于PGC-1α在魚(yú)類(lèi)中的序列特征分析尚缺乏。本研究獲得了齊口裂腹魚(yú)PGC-1α基因的cDNA序列，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)齊口裂腹魚(yú)具有其他哺乳動(dòng)物所有的MyOD、CREB、C/EBP等結(jié)合位點(diǎn)，但不存在MEF-2和胰島素應(yīng)答序列（IRS）結(jié)合位點(diǎn)。PGC-1α蛋白質(zhì)序列與其他脊椎動(dòng)物具有相似的典型結(jié)構(gòu)域，即N端含有LXXLL轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，C端含有RNA結(jié)合區(qū)和SR結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)同源性分析發(fā)現(xiàn)，齊口裂腹魚(yú)的PGC-1α與同鯉科的草魚(yú)、金魚(yú)和斑馬魚(yú)的同源性較高，分別為93%、91%和88%，但與陸生動(dòng)物的同源性較低。以上數(shù)據(jù)提示PGC-1α可能在魚(yú)類(lèi)和陸生動(dòng)物中存在相同和不同的作用。

為了研究PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)肌肉中的調(diào)控作用，我們用半定量RT-PCR方法檢測(cè)了其在齊口裂腹魚(yú)白肌和紅肌中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)下，PGC-1α在紅肌中的表達(dá)顯著高于白肌中。這與PGC-1α的組織表達(dá)特異性相符，因?yàn)榕c白肌相比，紅肌富含線粒體。Tiraby等也指出，PGC-1α在新生兒及哺乳動(dòng)物的棕色脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于白色脂肪細(xì)胞[12]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。對(duì)陸上動(dòng)物，多采用體外誘導(dǎo)PGC-1α表達(dá)來(lái)研究該基因在肌肉中的功能，如通過(guò)運(yùn)動(dòng)、溫度等探討其對(duì)肌肉線粒體和肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)換的影響，但這2種手段在魚(yú)類(lèi)中難以施展[8-9,13]。我們還檢測(cè)了禁食狀態(tài)下PGC-1α在紅肌和白肌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)禁食可以顯著誘導(dǎo)該基因在齊口裂腹魚(yú)肌肉中的表達(dá)水平，提示可以通過(guò)禁食誘導(dǎo)PGC-1α表達(dá)，進(jìn)而檢測(cè)與肌肉能量代謝相關(guān)基因的變化，最終闡明PGC-1α在肌肉中的調(diào)控作用。

圖3 齊口裂腹魚(yú)PGC-1α核苷酸序列和推測(cè)的氨基酸序列

圖4 齊口裂腹魚(yú)PGC-1α氨基酸序列進(jìn)化樹(shù)

圖5 PGC-1α在齊口裂腹魚(yú)紅肌和白肌中的表達(dá)

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