快速誘導(dǎo)細胞凋亡及檢測方法研究

周良彬，雷航，譚文佳，陳俊鵬，周曉，余曉麗

武漢工業(yè)學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023

隨著細胞凋亡檢測技術(shù)的不斷發(fā)展和日漸成熟，細胞凋亡檢測的實驗室教學(xué)也顯得頗為重要。然而，用于科學(xué)研究的檢測方法由于耗材、耗時、操作繁瑣等原因不適合實驗教學(xué)，所以研究如何快速誘導(dǎo)細胞凋亡，建立經(jīng)濟、簡便、快速的檢測細胞凋亡的實驗室教學(xué)方法是目前實驗教學(xué)中亟待解決的問題。細胞凋亡的誘導(dǎo)因素主要有物理因素、化學(xué)因素及生物因素。物理因子包括射線、水澇[1]、高滲、機 械 脅 迫 等 ；化 學(xué) 因 子 有H2O2[2]、營 養(yǎng) 因 子[3]、NaCl、AlCl3、CaCl2等鹽溶液[4-7]；生物因子涵蓋激素、細胞生長因子等。我們選擇NaCl、CaCl2脅迫誘導(dǎo)法進行細胞凋亡的快速誘導(dǎo)，操作簡便、經(jīng)濟，更適用于實驗室教學(xué)。采用甲基綠-派諾寧試劑可對動、植物細胞進行細胞凋亡的快速檢測，凋亡細胞核染成藍綠色，細胞質(zhì)染成紅紫色。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥鱗莖內(nèi)表皮、大蒜根尖、雞血。

離子脅迫誘導(dǎo)溶液：NaCl、無水CaC12、蒸餾水。

雞血紅細胞處理液：0.75%生理鹽水、Hanks液。

甲基綠-派諾寧試劑：2%甲基綠水溶液6 mL、5%派諾寧水溶液2 mL、0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH4.8）（0.1 mol/L醋酸 40 mL，0.1 mol/L醋酸鈉60 mL）16 mL、蒸餾水 16 mL，臨用時混合，存于冰箱中，可用數(shù)次。

1.2 離子脅迫誘導(dǎo)法探討最佳誘導(dǎo)濃度

取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。自培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L共5個不同濃度梯度的NaCl、CaCl2離子脅迫處理2 h后，用顯微鏡觀察其形態(tài)變化。

1.3 離子脅迫誘導(dǎo)法探討最適誘導(dǎo)時間

取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。自培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，用0.4 mol/L的CaC12溶液誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間分別為 2、4、6、8、10、12、14 h，用光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化并計數(shù)。

1.4 甲基綠-派諾寧染色法檢測洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞的凋亡

1.4.1 洋蔥鱗莖內(nèi)表皮預(yù)處理及凋亡誘導(dǎo) 取新鮮洋蔥在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)小時，使其活化。從培養(yǎng)好的洋蔥鱗莖上切取1 cm2左右的內(nèi)表皮若干，分成3組。第1組正對照，為正常細胞；第2組試驗組，于0.4 mol/L的CaCl2溶液中培養(yǎng)8 h得到的凋亡細胞；第3組負對照，為煮沸5 min的壞死細胞。

1.4.2 染色與鏡檢 將上述3組處理后的材料分別用甲基綠-派諾寧染色15～20 min，然后制片鏡檢觀察，比較,各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

1.5 甲基綠-派諾寧染色法檢測大蒜根尖細胞的凋亡

1.5.1 大蒜根尖的預(yù)處理及凋亡誘導(dǎo) 取新鮮大蒜在室溫下于清水中培養(yǎng)數(shù)天，使其長出新根。將長出新根的大蒜剪下根尖長約1 cm，分成3組。第1組正對照，為正常細胞；第2組試驗組，于0.4 mol/L的CaCl2溶液中培養(yǎng)8 h得到的凋亡細胞；第3組負對照，為煮沸5 min的壞死細胞。

1.5.2 染色與鏡檢 將上述3組分別用甲基綠-派諾寧染液染色15～20 min，然后制片壓片（注意壓片適當(dāng)，使細胞充分分開），鏡檢觀察，比較各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

1.6 甲基綠-派諾寧染色法檢測雞血紅細胞的凋亡

1.6.1 雞血紅細胞的預(yù)處理及誘導(dǎo)凋亡 取新鮮的雞血懸浮液3 mL左右，以4500 r/min離心5 min，棄上清液，加Hanks液，混勻，制成10%的雞血細胞懸浮液。分別向3只小燒杯中加入上述懸浮液1 mL，向其中一只中滴加1 mL 0.4 mol/L的CaCl2溶液，靜置8 h；向另一只中滴加0.75%生理鹽水1 mL；向最后一只中滴加0.75%生理鹽水1 mL，紫外線照射約20 min。

1.6.2 染色與鏡檢 取一滴10%的雞血細胞懸浮液于載玻片上，滴加一滴甲基綠-派諾寧染液，靜置15～20 min，用濾紙吸去染液，在酒精燈旁烘干固定（或用吹風(fēng)機吹干），用水慢慢沖洗裝片上的染液（水流不宜過激），再用吸水紙吸去載玻片上的水分，在酒精燈旁烘干固定（或用吹風(fēng)機吹干）。鏡檢觀察，比較各組細胞的形態(tài)特征和顏色變化并拍照。

2 結(jié)果

2.1 離子脅迫最佳誘導(dǎo)濃度

據(jù)實驗觀察，經(jīng)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L濃度梯度的NaCl、CaCl2離子脅迫處理后均能誘導(dǎo)細胞凋亡，但凋亡的程度不同。表1簡要描述了經(jīng)不同濃度離子處理8 h后的細胞形態(tài)。

用不同濃度離子處理洋蔥鱗莖內(nèi)表皮后，取樣并制片，每種處理各選取3個視野，統(tǒng)計總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)（以細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的邊緣化凝集為標(biāo)志），計算凋亡率［凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%］。以離子濃度為x軸、凋亡率為y軸，繪制誘導(dǎo)離子濃度與凋亡率之間的關(guān)系圖（圖1），可以看出，采用離子脅迫誘導(dǎo)法時，離子脅迫誘導(dǎo)劑濃度為0.4 mol/L有較高的凋亡率，且CaCl2的誘導(dǎo)效果較NaCl好。

2.2 離子脅迫最適誘導(dǎo)時間

誘導(dǎo)1 h未出現(xiàn)凋亡小體，隨著誘導(dǎo)時間的延長，凋亡細胞的數(shù)目逐漸增加，誘導(dǎo)5 h時明顯出現(xiàn)凋亡小體，若繼續(xù)延長處理時間，凋亡現(xiàn)象更加明顯，但同時壞死細胞數(shù)量也大大增加，出現(xiàn)細胞膜破損、細胞核裂解、細胞內(nèi)含物外泄等現(xiàn)象，不能保持細胞完整性。

表1 5種不同濃度離子處理8 h后的細胞凋亡形態(tài)學(xué)描述

圖1 誘導(dǎo)劑濃度與凋亡關(guān)系曲線

用不同時間梯度誘導(dǎo)洋蔥鱗莖內(nèi)表皮后，取樣并制片，每種處理各選取3個視野，統(tǒng)計總細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)（以細胞核染色質(zhì)出現(xiàn)明顯的邊緣化凝集為標(biāo)志），計算凋亡率［凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)）×100%］。以離子濃度為x軸、凋亡率為y軸，繪制誘導(dǎo)時間與凋亡率之間的關(guān)系圖（圖2），可以看出，采用離子脅迫誘導(dǎo)法時，誘導(dǎo)8 h左右有較高的凋亡率。

2.3 甲基綠-派諾寧染色法檢測洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞凋亡

對比圖3A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成紅色，細胞質(zhì)部分染成淺紅色，細胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象明顯，細胞質(zhì)高度濃縮，細胞核內(nèi)出現(xiàn)泡狀結(jié)構(gòu)，且某些細胞的細胞核消失，形成大量凋亡小體；死亡細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，其細胞核呈藍色，細胞質(zhì)無色。

2.4 甲基綠-派諾寧染色法檢測大蒜根尖細胞凋亡

對比圖4A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成紅色，細胞質(zhì)部分染成紅色，且出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離，部分細胞核呈不規(guī)則狀；死亡細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，細胞核呈藍色，細胞質(zhì)無色。

2.5 甲基綠-派諾寧染色法檢測雞血紅細胞凋亡

對比圖5A、B可知，經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，凋亡細胞的細胞核染成藍色，細胞質(zhì)染成紅色；壞死細胞經(jīng)甲基綠-派諾寧染色后，細胞核呈紅色。

圖2 誘導(dǎo)時間與凋亡率的關(guān)系曲線

圖3 Ca2+脅迫誘導(dǎo)洋蔥鱗莖細胞的凋亡

3 討論

3.1 影響本實驗的因素

本實驗采用3種不同實驗材料進行細胞凋亡的檢測，洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞的結(jié)果最好，原因在于其細胞較大，且為單層細胞結(jié)構(gòu)，因而容易觀察。大蒜根尖細胞排列較緊密，且是多層排列，故不宜分散。雞血紅細胞易分散，但細胞較小，故難以觀察，且容易凝集和破裂，難以對其做壞死處理。

凋亡現(xiàn)象的發(fā)生與誘導(dǎo)時間之間有著十分重要的關(guān)系。誘導(dǎo)2 h，染色現(xiàn)象并不明顯，誘導(dǎo)8 h時染色明顯。誘導(dǎo)劑的濃度也應(yīng)適當(dāng)，過高或過低都會對實驗造成影響。誘導(dǎo)劑濃度過低，凋亡不明顯；濃度過高，會使細胞繼發(fā)性壞死。

染色時間對實驗結(jié)果也有很大影響，染色時間短時現(xiàn)象不明顯，染色時間過長也會對實驗結(jié)果造成干擾。

3.2 Ca2+和Na+脅迫誘導(dǎo)細胞凋亡的可能機理

Ca2+和Na+等離子脅迫劑能刺激線粒體外膜上的受體，使線粒體膜通透性改變孔（mitochondrion permeability transition pore，PT孔）不可逆性開放，線粒體跨膜電位消失，通透性增高，從而導(dǎo)致細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等促凋亡物質(zhì)的釋放，最終導(dǎo)致細胞凋亡[8]。

圖4 Ca2+脅迫誘導(dǎo)大蒜根尖細胞的凋亡

圖5 Ca2+脅迫雞血紅細胞的凋亡

目前的研究表明，在許多細胞凋亡過程中，都伴隨胞內(nèi)自由Ca2+的大幅增加，特別是在凋亡早期，Ca2+往往表現(xiàn)出急劇增加，提示Ca2+可能是啟動細胞凋亡的早期信號[9]。細胞內(nèi)、外的一些凋亡因子，可能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體上的鈣通道，使其中的Ca2+大量釋放，并打開質(zhì)膜上的鈣通道，使胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+增加，進而誘導(dǎo)細胞凋亡[10]。而Ca2+依賴性的凋亡信號途徑又可以被高鹽（NaCl）所誘導(dǎo)。本實驗中，CaCl2中的Ca2+可能通過細胞質(zhì)膜上的鈣通道進入細胞質(zhì)，使細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度急劇增加，從而高效誘導(dǎo)細胞凋亡。并且，Ca2+還能激活相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶及參與凋亡相關(guān)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)等。因此，CaCl2對凋亡的誘導(dǎo)效率比單純的鹽脅迫劑NaCl略高。

3.3 甲基綠-派諾寧對凋亡細胞染色的機理

細胞凋亡和壞死均可表現(xiàn)為細胞核固縮等細胞死亡形態(tài)，但兩者的發(fā)生機制不同。細胞凋亡是一種細胞主動死亡過程，需要細胞內(nèi)蛋白酶的激活，細胞質(zhì)內(nèi)常有mRNA表達的增強。而壞死則是一種被動的細胞死亡過程，細胞質(zhì)內(nèi)常有RNA損失。根據(jù)這一特點，可利用試劑甲基綠對DNA染色的特異性和派諾寧對RNA的親和性。甲基綠對染色質(zhì)中的DNA選擇性結(jié)合顯示綠色或藍色，派諾寧與核仁、細胞質(zhì)中的RNA選擇性結(jié)合顯示紅色。如果細胞質(zhì)內(nèi)核糖核酸呈派諾寧陽性染色（紅紫色）者為凋亡細胞，呈陰性染色（藍綠色）者為壞死細胞。

3.4 結(jié)語

我們采用離子脅迫誘導(dǎo)法測得誘導(dǎo)洋蔥鱗莖細胞凋亡的最適離子濃度為0.4 mol/L，最佳誘導(dǎo)時間為8 h，最佳誘導(dǎo)劑為CaCl2。采用甲基綠-派諾寧染色法，可檢測到洋蔥鱗莖細胞、大蒜根尖細胞、雞血紅細胞的凋亡現(xiàn)象，其中洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞凋亡現(xiàn)象最為明顯。該方法實驗現(xiàn)象明顯，易于觀察，操作簡便，能為實驗教學(xué)提供快捷、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的方案。同時，采用甲基綠-派諾寧法進行細胞凋亡的快速檢測，對于腫瘤、宮頸糜爛等疾病的檢測也有一定的臨床應(yīng)用價值。

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