血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子啟動子突變體螢光素酶報告基因載體的構(gòu)建

張述 ，劉婕 ，劉世翠 ，林婭紅 ，3，張亞楠 ，丁麗華 ，葉棋濃

1.廈門長庚醫(yī)院，福建 廈門 361028；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，北京 100850；3.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

腫瘤的生長擴(kuò)增以及向遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)移都與腫瘤血管的生成密切相關(guān)，如果缺乏毛細(xì)血管，移植瘤體的直徑將被限制在0.4 mm左右，腫瘤細(xì)胞容易發(fā)生壞死或凋亡，控制腫瘤的血管生成可以有效限制腫瘤的生長及侵襲[1]。在腫瘤發(fā)展相對較早的階段即開始有血管生成，腫瘤血管的增加與腫瘤的生長、血行轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有著密切的關(guān)系[2-3]。腫瘤細(xì)胞分泌的許多細(xì)胞因子都可以刺激血管生成。在現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的促血管生成因子中，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vas?cular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成調(diào)節(jié)因子，在多種血管生成中起核心調(diào)控作用。VEGF在多種腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移的多個過程中都發(fā)揮著重要作用。VEGF家族有多個成員，其中VEGF-A分布范圍較廣，且作用較大。VEGF-A基因位于染色體6p21.3，全長28 kb，編碼VEGF-A的基因序列約14 kb，啟動子區(qū)域約為2400 bp，該啟動子上含有多個轉(zhuǎn)錄反應(yīng)元件。對VEGF轉(zhuǎn)錄具有調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子很多，包括激活蛋白 1（activator protein-1，AP-1）、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）等。HIF-1 是介導(dǎo)腫瘤缺氧適應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在缺氧環(huán)境中表達(dá)增加，可使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧，促進(jìn)腫瘤生長、浸潤轉(zhuǎn)移[4-5]。HIF-1是異源二聚體蛋白，由亞基HIF-1α和 HIF-1β組成[6]。HIF-1α的表達(dá)與細(xì)胞的氧氣濃度相關(guān)，在多種腫瘤中，HIF-1α在缺氧條件下轉(zhuǎn)錄激活VEGF。

VEGF的表達(dá)調(diào)控主要是在轉(zhuǎn)錄水平，因此，對VEGF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入研究有重要意義。我們構(gòu)建了含VEGF啟動子不同片段的螢光素酶報告基因載體，檢測了不同片段報告基因與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子的-1128～-728區(qū)域可以與HIF-1α結(jié)合，并促進(jìn)VEGF啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。用構(gòu)建的報告基因載體可篩選新的調(diào)控VEGF啟動子活性的轉(zhuǎn)錄因子，為研究這些調(diào)節(jié)因子在腫瘤中的作用，尋找治療腫瘤的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎腎細(xì)胞293T由本實驗室保存，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基于含5%CO2的孵箱內(nèi)37℃常規(guī)培養(yǎng)；大腸桿菌 DH5α為本實驗室保存；pGL4-basic載體、質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司；含人全長VEGF啟動子序列的表達(dá)載體、HIF-1α真核表達(dá)載體由本實驗室保存；LA-Taq酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基、LipofectAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；DNA序列分析由奧科公司完成。

1.2 VEGF啟動子的PCR擴(kuò)增

根據(jù)GenBank中的VEGF啟動子序列（登錄號為AF095785），以VEGF啟動子全長為模板，PCR擴(kuò)增VEGF啟動子的5'端系列缺失突變體。引物及序列見表1，由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

上述PCR產(chǎn)物用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切處理的pGL4-basic載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，將PCR鑒定和酶切鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。

表1 引物及序列

1.4 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

將293T細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）轉(zhuǎn)種到24孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，24～36 h后轉(zhuǎn)染，分別將質(zhì)粒 DNA 和 1.6 μL Lipo?fectAMINE2000溶于50 mL不含血清、抗生素的DMEM培養(yǎng)基中，之后將二者混合，室溫放置20 min后加到24孔細(xì)胞板中。

1.5 螢光素酶和α-半乳糖苷酶活性測定

螢光素酶活性測定基本按照Promega公司試劑說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗1次，在24孔板中每孔加入80 μL裂解緩沖液，室溫輕搖15 min，將細(xì)胞裂解物收集到1.5 mL離心管中，持續(xù)振蕩5 min，4℃、12 000 r/min離心5 min，收集上清，取10 μL加到25 μL螢光素酶底物中，立即用熒光計測定螢熒光素酶活性。

用ONPG測定α-半乳糖苷酶活性。取上述上清10 μL 與 90 μL Z 緩沖 液/β-巰 基 乙 醇 溶 液（10 mL 16.1 g/L Na2HPO4·H2O，0.75 g/L KCl，0.246 g/L MgSO4·7H2O，27 μL β-巰基乙醇）混合，加入 20 μL 4 mg/mL ONPG，常溫放置，當(dāng)出現(xiàn)淺黃色時加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，測定樣品的D420nm值。

1.6 Western印跡

轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，加入SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，離心后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉1∶5000稀釋的Myc抗體或1∶10 000稀釋的GAPDH抗體，加入用5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗兔IgG，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次7 min，用化學(xué)發(fā)光法顯色5 min，壓片顯影。

1.7 不同片段VEGF啟動子報告基因載體活性測定

分 別 將 0.2 μg 質(zhì) 粒 pGL4-VEGF400、pGL4-VEGF800、 pGL4-VEGF1200、 pGL4-VEGF1597、pGL4-VEGF1982、pGL4-VEGF2377、pGL4-VEGF、pGL4-basic與0.1 μg表達(dá)α-半乳糖苷酶的質(zhì)粒和50 ng空載體XL-5或50 ng HIF-1α質(zhì)粒共同瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，測定螢光素酶和α-半乳糖苷酶活性，其中α-半乳糖苷酶活性用于校正細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。啟動子活性為細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率校正后的螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 VEGF啟動子的PCR擴(kuò)增

以VEGF啟動子全長為模板，PCR擴(kuò)增VEGF啟動子的5'端系列缺失突變體，長度分別為2377、1982、1597、1200、800、400 bp，DNA 凝膠電泳結(jié)果表明與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 VEGF啟動子報告基因載體的構(gòu)建

將上述PCR產(chǎn)物用XhoⅠ、HindⅢ雙酶切，克隆到經(jīng)同樣雙酶切處理的pGL4-basic載體中，抗性篩選得到的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定為陽性（結(jié)果未示）。酶切鑒定結(jié)果進(jìn)一步表明，該重組質(zhì)粒有與預(yù)期大小相似的插入片段，而空載體中無插入片段（圖2）。DNA序列分析結(jié)果證實該插入片段為VEGF啟動子（結(jié)果未示）。

2.3 確定VEGF啟動子與HIF-1α相互作用的最主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域

對照組空載體XL-5、5'端缺失突變體報告基因載體及VEGF全長啟動子轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄活性，發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子本身具有轉(zhuǎn)錄活性；轉(zhuǎn)染HIF-1α后，-328～+72、-728～+72 bp區(qū)域啟動子轉(zhuǎn)錄活性沒有明顯升高，而-1128～+72 bp區(qū)域啟動子轉(zhuǎn)錄活性在結(jié)合HIF-1α后由182增至385，約升高了2.1倍（P＜0.05）。因此，HIF-1α可能結(jié)合在-728～-1128 bp區(qū)域（圖3）。通過序列分析，我們發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子-728～-1128 bp區(qū)域存在HIF-1α 結(jié) 合 序 列 HRE（HIF-1 response element，TACGTGGG），這與我們的結(jié)果是一致的。Western印跡表明，帶Myc標(biāo)簽的HIF-1α真核表達(dá)載體成功表達(dá)（圖4）。因此，-1128～+72 bp區(qū)域啟動子與HIF-1α表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染活性升高是由于啟動子和HIF-1α相互作用引起的。

圖1 VEGF啟動子不同片段的PCR擴(kuò)增

圖2 pGL3-VEGF不同片段的XhoⅠ和HindⅢ酶切鑒定圖

3 討論

VEGF在腫瘤血管生成中起核心作用，因此，抗VEGF信號通路治療成為研究熱點(diǎn)[7-8]。通過阻斷VEGF及其受體導(dǎo)致的血管通透性的增加，可抑制腫瘤的生長。VEGF的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，因此，通過轉(zhuǎn)錄因子對VEGF的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控是最主要的途徑。轉(zhuǎn)錄因子不僅可直接結(jié)合在VEGF的啟動子上促進(jìn)VEGF的轉(zhuǎn)錄，而且可通過與生長因子、癌基因和抑癌基因的相互作用發(fā)揮調(diào)控VEGF表達(dá)的功能。因此，對VEGF表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行深入研究，有助于闡明腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移機(jī)理，確立診斷和預(yù)后指標(biāo)，以及開發(fā)有效的腫瘤治療藥物。

我們所克隆的VEGF-A啟動子全長序列是細(xì)胞中天然存在的。VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因分析表明，VEGF啟動子-328～+72 bp區(qū)具有最高的轉(zhuǎn)錄活性，這與已報道的結(jié)果一致；-328～+72 bp區(qū)域是VEGF轉(zhuǎn)錄因子Sp1、AP2、Egr-1等的結(jié)合位點(diǎn)。應(yīng)用VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因與HIF-1α共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)HIF-1α結(jié)合在VEGF啟動子-718～-1128 bp區(qū)域，通過序列分析，我們發(fā)現(xiàn)此區(qū)域存在HRE序列[9-10]。VEGF全長啟動子及5'端缺失突變體報告基因載體的構(gòu)建，為進(jìn)行轉(zhuǎn)錄活性測定實驗、研究其他轉(zhuǎn)錄因子與VEGF啟動子的相互作用及其相互作用的區(qū)域、篩選新的針對腫瘤血管生成相關(guān)的治療靶點(diǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

圖3 VEGF啟動子不同片段與HIF-1α相互作用的轉(zhuǎn)錄活性測定

圖4 Western印跡鑒定HIF-1α在293T細(xì)胞中的表達(dá)

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