苜蓿素對人直腸癌SW1116細胞增殖和凋亡的作用及其機制

陳 艷，姚 宏，林新華

1福建醫(yī)科大學藥學院藥物化學系;2福建醫(yī)科大學藥學院藥物分析系，福州 350004

苜蓿素(Tricin，4'，5，7-三羥基-3'，5'-二甲氧基黃酮)是天然黃酮的一種，廣泛存在于中草藥中，也存在小麥、大麥、米等谷類食物中［1］。有報道，苜蓿素可抑制結(jié)腸癌SW480細胞、HT29細胞菌落的形成［2］;也可抑制人 MDA-MB-468乳腺癌細胞，阻滯細胞周期于G2/M，但未誘導(dǎo)凋亡［3］;通過抑制COX酶和PGE2，從而降低了ApcMin鼠腺瘤的發(fā)生［4］。苜蓿素對人結(jié)腸癌細胞的作用機制尚未見報道，本研究觀察苜蓿素對人結(jié)腸癌SW1116細胞增殖和凋亡的作用，并探討其作用機制。

1 材料

電泳儀(美國EC公司)、熒光顯微鏡IX70(O-lympus)、流式細胞儀(BD FACSCalibur)、Gel DOC 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)、DYCP-31C型電泳槽(北京六一儀器廠)和Microplate Reader 450酶標儀(美國Bio-Rad公司)。人直腸癌SW1116細胞株購自中國科學院上海細胞所，細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液中，在37℃，飽和濕度及5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)進行細胞傳代培養(yǎng)，實驗時取對數(shù)生長期細胞;苜蓿素為本實驗室從蒲葵子中提取分離得到(經(jīng)HPLC測定，面積歸一化法檢測，苜蓿素的質(zhì)量分數(shù)為 99.0%)［13］。RPMI-1640(Gibico公司)，小牛血清、DMSO、MTT均購自Amresco公司，DNA Mark、DNA Ladder抽提試劑盒(離心柱式)購自碧云天試劑有限公司，細胞凋亡試劑盒為南京凱基，BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀，ECL增強型化學發(fā)光底物檢測試劑盒為北京中杉。吖啶橙(AO，F(xiàn)luka公司)，溴化乙錠(EB，華美公司)，碘化丙啶(PI，Sigma公司);其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 MTT法檢測苜蓿素對SW1116細胞生長抑制實驗

取對數(shù)生長期的SW1116細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種180 μL，細胞接種密度為2×104/mL，在37°C，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。之后，藥物組加入等體積不同濃度的藥物20 μL/孔，使其終濃度分別為 100，20，4，0.8，0.16 μg/mL;每組濃度設(shè)3個復(fù)孔。在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)孵育4 h 后，棄凈上清液，每孔加入150 μL DMSO，37 °C 振蕩10 min，使其充分溶解。酶聯(lián)檢測儀492 nm波長處測定吸光度(A)值。計算細胞生長抑制率，抑制率(IR%)=［(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)］×100%;以不同濃度的苜蓿素為橫座標，以抑制率為縱坐標，繪制苜蓿素對SW1116細胞增殖抑制的影響曲線，并計算半數(shù)抑制濃度IC50值。

2.2 熒光顯微鏡觀察苜蓿素對SW1116細胞生長形態(tài)的影響

取對數(shù)生長期SW1116細胞，全培養(yǎng)液稀釋成4×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，加入不同濃度的苜蓿素，使終濃度分別為20，4 μg/mL;設(shè)立對照組(加入等體積溶劑的培養(yǎng)液)，孵育72 h，加入10 μL丫啶橙AO和溴化乙錠EB混合液，立即置熒光顯微鏡觀察并拍照(激發(fā)波長490 nm)。

2.3 流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期分布

收集 60，20，2 μg/mL 苜蓿素作用 72 h 的SW1116細胞，PBS洗滌細胞，加入70%冷乙醇固定過夜，離心去除乙醇，PBS洗滌細胞，加入RNase(0.5 mg/管)，輕輕懸浮細胞，37 °C 孵育30 min。4 °C避光PI染色30 min，用300目濾網(wǎng)過濾，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞周期分布和凋亡。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳分析DNA Ladder測定

取對數(shù)生長期的SW1116細胞，以含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋并接種于6孔板上，使成5×104個/孔，37°C 、5%CO2條件下孵育24 h后，加藥，使苜蓿素的終濃度為 100，20，4 μg/mL，同時設(shè)空白對照組，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集細胞，按照DNA Ladder試劑盒說明書方法進行 DNA提取。DNA上樣5 μL，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，2 V/cm，電泳分析，將凝膠浸入EB中染色30 min，采用凝膠成像分析儀觀察并照像［5］。

2.5 Western Blotting檢測蛋白表達

根據(jù)待測蛋白要求制膠，上樣(100 μg/孔)，電泳，電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜，取下膜用Fast Green Solution預(yù)染，洗10 min，標記Marker，裁剪膜，5%(w/v)脫脂奶粉室溫封閉30 min，TBST洗10 min，加一抗4°C孵育過夜，TBST洗5×3 min，加二抗室溫輕搖40 min，TBST洗5×3 min，發(fā)光試劑盒顯色1 min，放入暗盒，固定，拍片，標記分析存檔。所有結(jié)果采用β-Tubulin為內(nèi)參，用Densitometry(Molecular Dynamics)灰度掃描軟件對蛋白條帶進行半定量分析。

2.6 統(tǒng)計學處理

3 結(jié)果

3.1 苜蓿素對SW1116細胞生長的抑制作用

人結(jié)腸癌細胞SW1116對苜蓿素敏感，藥物作用72h后，隨著苜蓿素藥物濃度的升高，細胞抑制率升高，呈劑量依賴性(見圖1)，其中得出IC50值的苜蓿素作用濃度為8.11 μg/mL。

圖1 不同濃度苜蓿素作用72 h對細胞抑制率的影響Fig.1 Inhibition rate of SW1116 cells after treated by tricin with different concentration for 72 h

3.2 苜蓿素對SW1116細胞生長形態(tài)的影響

通過熒光顯微鏡觀察，AO/EB染色后，對照組細胞全部被染成綠色，細胞壁完整(見圖2A)。苜蓿素(4 μg/mL)組SW1116細胞，出現(xiàn)大量的核染色質(zhì)呈固縮狀或圓珠狀(見圖2B);苜蓿素(20 μg/mL)作用72 h后，可見明顯的粒狀熒光體聚集，即凋亡小體，同時可見大量細胞裂解、壞死，發(fā)出紅色熒光(見圖2C)。

圖2 不同濃度的苜蓿素對SW1116細胞生長形態(tài)的影響(AO/EB染色，×400)Fig.2 Morphological alterations of SW1116 cells which were treated by tricin with different concentrations(AO/EB staining，×400)

3.3 苜蓿素對SW1116細胞凋亡的影響

流式細胞儀對細胞周期分布的檢測結(jié)果表明，苜蓿素作用72 h后，細胞出現(xiàn)G0/G1期堆積，G2/M細胞的比例明顯降低;細胞凋亡比例開始上升，由中濃度時的7.87%，上升為高濃度時的16.04%，揭示苜蓿素可以阻滯SW1116細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡(見表1;圖3)。

圖3 苜蓿素對SW1116細胞生長周期的影響圖Fig.3 Effect of tricin on cell cycle distribution

3.4 瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA結(jié)構(gòu)變化

SW1116細胞經(jīng)不同濃度的苜蓿素作用72 h后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳譜顯示，出現(xiàn)“階梯狀”DNA Ladder帶，大小分別約為100～200 bp，細胞發(fā)生凋亡。陰性對照組細胞未見DNA Ladder，4 μg/mL苜蓿素作用72 h，開始出現(xiàn)DNA Ladder，且隨著給藥濃度的加大，DNA Ladder條帶越明顯，表明苜蓿素能引起細胞內(nèi)DNA發(fā)生斷裂，從而導(dǎo)致細胞凋亡。

圖4 DNA斷裂電泳分析Fig.4 DNA fragmentation electrophoresis

3.5 苜蓿素對SW1116細胞相關(guān)蛋白的影響

用苜蓿素 60，20，2 μg/mL 作用 SW1116 細胞72 h后，Western blot檢測凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的水平。隨苜蓿素劑量增大，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平逐漸變淡，苜蓿素60 μg/mL下調(diào)作用最明顯，而促凋亡蛋白Bax條帶灰度則逐漸增粗，呈量效關(guān)系(見圖5)。

圖5 苜蓿素對SW1116細胞蛋白表達的影響Fig.5 The influence of protein expression on SW1116 cells by tricin

4 討論

癌癥嚴重威脅著人類的健康和生命安全，目前發(fā)病率和死亡率均呈逐年上升趨勢。因此，研究高效、低毒的抗癌藥物具有重要意義，而從中草藥中尋找高效、低毒的抗腫瘤成分已經(jīng)成為現(xiàn)代抗腫瘤藥物發(fā)展的熱點之一［6］，如紫杉醇、喜樹堿、雷公藤內(nèi)堿、三尖杉酯堿等。蒲葵子為棕櫚科蒲葵屬植物蒲葵Livistona chinensis(Jacq.)R.Br．的種子，民間廣泛用其治療各種癌癥，現(xiàn)代藥理學研究也證實其抗癌療效顯著［7-12］。由于迄今蒲葵子抗腫瘤的藥效基礎(chǔ)尚不明確，特別是有效成分及其機制缺乏系統(tǒng)研究。本實驗室對蒲葵子進行系統(tǒng)的分離，其中分離得到的苜蓿素是一種天然的黃酮成分，且其在蒲葵子中的含量較高［13］，因此對其活性進行研究。

本實驗采用不同濃度的苜蓿素處理SW1116細胞，AO/EB熒光染色分析，出現(xiàn)凋亡的典型特征，并可見凋亡小體。通過DNA電泳譜顯示，SW1116細胞經(jīng)不同濃度的苜蓿素作用72 h后，出現(xiàn)“階梯狀”DNA Ladder帶，且給藥濃度越大，DNA Ladder條帶越明顯，提示苜蓿素導(dǎo)致SW1116細胞核酸內(nèi)切酶激活DNA降解，誘導(dǎo)細胞凋亡。另外，采用流式細胞儀分析了各時相的細胞周期分布情況，結(jié)果顯示苜蓿素可以阻滯細胞周期，使腫瘤細胞產(chǎn)生選擇性的G0/G1期堆積，影響細胞生長，從而抑制細胞增殖。

Bcl-2是一種原癌基因，其家族成員分兩類，如Bcl-X1、Mcl-1、Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白和 Bax、Bad、Bak、Bid等促凋亡蛋白［14］。當 Bc1-2過表達時，與Bax形成異二聚體抑制細胞凋亡;相反，Bax過表達時，Bax形成同源二聚體促進細胞凋亡。Bcl-2和Bax對細胞凋亡的調(diào)控不僅取決于自身表達水平高低，還與兩者的比例有關(guān)。當Bcl-2/Bax比例減少時，導(dǎo)致游離型Bax蛋白相對增多。而游離型Bax可以使線粒體外膜發(fā)生滲漏化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，引發(fā)經(jīng)線粒體途徑介導(dǎo)的細胞死亡［15］。本實驗通過蛋白免疫印跡法檢測了Bcl-2和Bax蛋白水平，用苜蓿素處理SW1116細胞72 h后，Bcl-2蛋白表達低于對照組，而Bax表達增強。苜蓿素引起B(yǎng)cl-2/Bax比例減少，是通過死亡受體途徑及線粒體途徑引起細胞凋亡，從而抑制細胞增殖。

由此可推知，苜蓿素為蒲葵子可能的有效成分之一，提取分離工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，可以大量制備。另外也說明苜蓿素可能通過阻滯細胞周期及誘導(dǎo)細胞凋亡共同作用來發(fā)揮抗腫瘤作用，為蒲葵子活性評價提供可靠的依據(jù)。

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