三角葉黃連內(nèi)生真菌產(chǎn)物紅色色素的穩(wěn)定性研究

譚友莉，馬云桐，嚴(yán)鑄云，馬 慶

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137

天然色素大多具有一定的營養(yǎng)與保健作用，所以在一些西方發(fā)達(dá)國家天然色素備受青睞，如玉米黃、高粱紅等已經(jīng)普遍使用。課題組前期從三角葉黃連內(nèi)生真菌中篩選獲得一株可產(chǎn)天然紅色色素的菌株，該菌株通過固體發(fā)酵、提取、分離后得到紅色色素。經(jīng)初步研究證明其具有一定的開發(fā)與利用價(jià)值。但天然色素存在的顯著問題是穩(wěn)定性差［1-3］，著色力不好［4］。而穩(wěn)定性的好壞直接影響著色物質(zhì)的色澤和品質(zhì)［5］。為此本實(shí)驗(yàn)開展對此紅色素穩(wěn)定性的研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用該紅色素提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

來源于毛茛科植物三角葉黃連(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsial)中分得的內(nèi)生真菌，經(jīng)顯微鑒定為半知菌類(Fungi Imperfecti)的無孢菌群(Mycelia Sterilia)［6］，并用該菌株采用固體發(fā)酵所得菌絲產(chǎn)物，經(jīng)提取、分離后獲得的紅色色素作為實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 試劑

CaCl2、A1C13、ZnSO4、FeC13、MgC12、Na2SO4、K2SO4、H2O2、NaOH、Na2SO3;二氯甲烷、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、山梨酸鉀、葡萄糖、明膠、苯甲酸鈉、食鹽等均為分析純或食品級(以上化學(xué)試劑均購自成都科龍化工試劑廠);維生素A、維生素B、維生素D、維生素E(購自成都錦華藥業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

JA1003電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);MCD-B161F干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);HP8453紫外/可見分光光度計(jì)(美國惠普公司);HH-S24數(shù)顯恒溫水浴鍋(成都雅榮實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);KQ-5200E型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

稱取適量紅色素樣品和石英砂按1∶5(m/m)的比例置研缽中研磨成粉末。將粉末置于圓底燒瓶中，加入10倍量的二氯甲烷溶液，搖勻后在40℃超聲1 h后取出離心，上清液即為紅色素提取液。

1.2.2 光譜掃描

取上述樣品溶液，置于HP8453紫外/可見分光光度計(jì)下，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，檢測最大吸收峰，測得結(jié)果為515 nm，將其作為測定波長。

1.2.3 溫度對紅色素穩(wěn)定性的影響

分別取樣品溶液 10 mL，置于 40、50、60、70 ℃(沸騰溫度)水浴鍋中恒溫處理1～5 h，每隔1 h取出部分樣品，避光靜置0.5 h，測定其在515 nm處的吸光度值，并計(jì)算色素殘存率，并分析不同溫度條件對紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.4 光照對紅色素穩(wěn)定性的影響

分別取樣品溶液10 mL，置于暗室、室內(nèi)散射光、室外日光及紫外光下，每隔5 h測定其在最大吸收波長515 nm處的吸光度值并計(jì)算殘存率，分析不同光照條件對紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.5 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響

分別取等量制備樣品，滴加0.01、0.05、0.1 mmol/L 的 CaCl2、A1C13、ZnSO4、FeC13、MgC12、Na2SO4、K2SO4后，并超聲30 min使其充分溶解，并與空白組對照，觀察紅色素溶液顏色變化，在室溫下靜置24 h后測定其在515 nm處的吸光度值，并計(jì)算色素殘存率。

1.2.6 氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

將過氧化氫(H2O2)溶液分別配成濃度為0.5%、1.5%和3%的紅色素溶液，以不加H2O2為對照組(0%)。并于2、4、8 h測定其在515 nm處的吸光度值，計(jì)算色素殘存率并分析不同濃度下氧化劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.7 還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

將抗壞血酸和亞硫酸鈉(Na2SO3)分別配成濃度為0%、0.02%、0.06%和0.10%的紅色素溶液，置于暗室中放置，并于2、4、8 h測定其在515 nm處的吸光度值，計(jì)算色素殘存率并分析不同還原劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.8 酸度調(diào)節(jié)劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

將檸檬酸、氫氧化鈉、蘋果酸和檸檬酸鈉分別配成濃度均為2%的紅色素溶液，以純的紅色素提取液為對照。置于室內(nèi)暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，計(jì)算色素殘存率并分析不同酸度調(diào)節(jié)劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.9 維生素對紅色素穩(wěn)定性的影響

將VA、VB、VD和VE分別配成濃度均為0.1%的紅色素溶液，作定性考察，以純的紅色素提取液為對照。置于室內(nèi)暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，分析不同維生素試劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.10 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

分別將葡萄糖、氯化鈉、明膠和苯甲酸鈉配成濃度均為3%的紅色素溶液，作定性考察。另將苯甲酸鈉分別配成濃度為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的紅色素溶液，觀察不同濃度苯甲酸鈉對紅色素的影響，以純的紅色素提取液為對照。置于室內(nèi)暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，分析不同食品添加劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

1.2.11 防腐劑山梨酸鉀對紅色素穩(wěn)定性的影響

將山梨酸鉀分別配成濃度為0.01%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%的紅色素溶液，以純的紅色素提取液為對照，置于室內(nèi)暗處放置，每隔5 h測定其在515 nm處的吸光度值，計(jì)算色素殘存率并分析不同防腐劑對樣品紅色素穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對色素穩(wěn)定性的影響

當(dāng)溫度在40℃～70℃條件下的紅色素吸光值變化如圖1所示。由圖1可知該紅色色素在不同水浴溫度條件下的有效含量相差不大，并且隨著水浴時(shí)間的延長其含量依然穩(wěn)定，吸光度無明顯變化，表明該紅色素的耐熱性較好。

圖3 紫外線對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of Ultrariolet rays on the stability of the red pigment

2.2 光照對紅色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)測定在避光、室內(nèi)散射光、室外直射光和紫外燈下樣品的吸光度值(OD515)結(jié)果:如圖2、3。

由圖2、3可知其吸光度值隨存放時(shí)間的延長幾乎無變化，表明三角葉黃連內(nèi)生真菌的這種紅色素具有較強(qiáng)的光適應(yīng)性。

2.3 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)測定樣品在不同濃度的金屬離子的吸光度值(OD515)結(jié)果見表1。

表1 金屬離子對紅色素穩(wěn)定性的影響Table 1 Effect of metal ions on the stability of the red pigments

由表1可知不同濃度的金屬離子Na+、Mg2+、A13+、Ca2+、K+對紅色素提取液具有一定增色作用，使天然紅色色素提取液的紅色加深;不同濃度梯度的Fe3+和Zn2+可使紅色色素溶液顏色變成深黃色，說明此紅色素提取物可能對Fe3+和Zn2+較敏感。由此可知，除Fe3+和Zn2+外的其他多種常見金屬離子在不同濃度下對紅色素影響較小。

2.4 氧化劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)測定含不同濃度的雙氧水(H2O2)的樣品吸光度值(OD515)結(jié)果見圖4。

圖4 雙氧水對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide on the stability of the red pigment

由圖4中可知，在2 h內(nèi)，不同濃度雙氧水處理處理，色素OD值變化不顯著;當(dāng)時(shí)間增加至4 h，紅色素的OD值明顯降低;繼續(xù)延長時(shí)間至8 h，紅色素的OD值無明顯下降。因此，紅色素對氧化劑雙氧水在一定的時(shí)間范圍內(nèi)呈時(shí)間依賴性，處理時(shí)間越長，殘留量越少。說明該色素對氧化劑的穩(wěn)定性較差。

2.5 還原劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)測定含不同濃度的亞硫酸鈉和抗壞血酸的樣品吸光度值(OD515)結(jié)果見圖5、6。

由圖5可知，隨著亞硫酸鈉(Na2SO3)的濃度和時(shí)間的增加，對紅色素有增益作用，對其穩(wěn)定性影響不明顯，說明該色素對亞硫酸穩(wěn)定性較好。由圖6可知，紅色素溶液中加維生素C后在處理2～4 h，其吸光度明顯下降，隨維生素C濃度的增加紅色素吸光度呈現(xiàn)下降趨勢。表明該色素不耐受還原劑抗壞血酸。由圖5、6可知，紅色色素對不同種類的還原劑的適應(yīng)性不同。

圖5 亞硫酸鈉對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of sodium sulfite on the stability of the red pigment

圖6 抗壞血酸對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of ascorbic acid on the stability of the red pigment

2.6 酸度調(diào)節(jié)劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

經(jīng)測定含2%的(檸檬酸鈉、蘋果酸和氫氧化鈉)樣品溶液吸光度值(OD515)結(jié)果見圖7。

圖7 酸度調(diào)節(jié)劑對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of acidity regulator on the stability of the red pigment

加入檸檬酸鈉后，處理25 h，溶液顏色幾乎不變，吸光度值變化不明顯;加入氫氧化鈉處理5 h，其吸光度值顯著下降42.04%，25 h時(shí)變?yōu)槲舛戎第吔?，并出現(xiàn)紅色沉淀。加入檸檬酸處理5 h后，吸光度值顯著下降為初始值的12.8% ，延長至25 h時(shí)，吸光度值未繼續(xù)下降，溶液變成亮黃色;加入蘋果酸處理5 h，吸光度值顯著下降為初始值的11.23%，延長至25 h時(shí)，吸光度值未繼續(xù)下降，溶液變成亮黃色。由此表明，檸檬酸鈉能夠維持三角葉黃連內(nèi)生菌的紅色天然色素的穩(wěn)定性，而檸檬酸、蘋果酸和氫氧化鈉對紅色素有某種破壞或者螯合作用。

2.7 維生素對紅色素穩(wěn)定性的影響

在紅色素提取液中加入濃度為0.1%的維生素后，其吸光度與色素溶液存放時(shí)間的關(guān)系曲線如圖7所示。

圖8 維生素對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of vitamin on the stability of the red pigment

由圖8可以看出加入Va、Vb、Vd和Ve試劑后隨著時(shí)間的延長，紅色素溶液的吸光度值幾乎沒有變化，表明該紅色素具有多種維生素的耐受性。

2.8 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響

在紅色素提取液中加入濃度為3%的葡萄糖、明膠、氯化鈉和苯甲酸鈉等常用食品添加劑后，其吸光度與色素溶液存放時(shí)間的關(guān)系曲線如圖8、9所示。

圖9 常用食品添加劑對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of common food additives on the stability of the red pigment

由圖9可知加入高濃度3%葡萄糖、氯化鈉和明膠后，隨時(shí)間的延長紅色素OD值基本沒有變化;加入3%的苯甲酸鈉，隨時(shí)間的延長，OD值顯著下降，處理5 h，紅色素OD值為0。

圖10 苯甲酸鈉對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of sodium benzoate on the stability of the red pigment

由圖10顯示不同濃度的苯甲酸鈉對紅色素OD值的影響，低濃度(＜0.5%)苯甲酸鈉對此紅色素OD值基本沒有影響，隨著濃度的升高，吸光度值顯著下降，加入1.0%的苯甲酸鈉處理5 h，紅色素OD值為初始的35.82%，25 h后，紅色素OD值為初始的5.7%;1.5%的苯甲酸鈉混合溶液5h后紅色素OD值為初始的26.78%，處理15 h后吸光度值降為0;2.0%苯甲酸鈉的混合溶液在5 h后最大吸光值即降為0，表明大于0.5%的苯甲酸鈉對此紅色素OD值影響顯著。

2.9 防腐劑山梨酸鉀對紅色素穩(wěn)定性的影響

為檢測防腐劑對三角葉黃連內(nèi)生菌的紅色色素穩(wěn)定性影響，測定了含不同濃度山梨酸鉀的色素提取液的吸光度值，如圖11所示。

圖11 山梨酸鉀對紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of potassium sorbate on the stability of the red pigment

由圖11可知，色素液中加入不同濃度的山梨酸鉀以后，當(dāng)濃度小于0.05%時(shí)，吸光度幾乎不變;在0.1% ～0.2%范圍內(nèi)，吸光度值略有下降，在25 h以后紅色素殘存率維持在95%左右，說明此紅色素對山梨酸鉀有較好的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

本文使用分光光度法，檢測了三角葉黃連的內(nèi)生菌發(fā)酵物中提取色素對多種日常生活成分的適應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)其對這些物質(zhì)的耐受程度存在較大差異，此結(jié)果有利于合理地開發(fā)、貯存這種新型的天然色素，為后續(xù)的深入研究奠定基礎(chǔ)。此紅色素在70℃下，具有較好的穩(wěn)定性，在加工、使用過程中，可一定程度上避免高溫加熱，保護(hù)其色澤。溫度、光照、維生素以及常用食品添加劑等對紅色素影響很小。此紅色素溶液在Fe3+和Zn2+的影響下變成黃色，有可能是紅色素和Fe3+和Zn2+絡(luò)合生成其它物質(zhì)，也可能由于直接和紅色素反應(yīng)引起色變;此紅色素對金屬離子Fe3+和Zn2+敏感，在生產(chǎn)、加工和儲存過程中應(yīng)避免與鐵器、鋁器接觸。氧化劑和還原劑抗壞血酸對此紅色素穩(wěn)定性影響明顯，避免混用;酸度調(diào)節(jié)劑中檸檬酸，蘋果酸和氫氧化鈉對紅色素溶液穩(wěn)定性影響大，該紅色素適合在中性或弱酸性條件下使用。此紅色素對苯甲酸鈉很敏感，苯甲酸鈉濃度不同時(shí)，對紅色素的影響差異很大，在使用時(shí)要特別注意。該紅色色素由多種成分混合而成，需進(jìn)一步經(jīng)過成分分離，結(jié)構(gòu)鑒定來研究證明，另一方面可以進(jìn)一步優(yōu)化其生產(chǎn)和提取工藝，篩選出保護(hù)色澤的最佳條件，以確保該色素能應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，提高其應(yīng)用價(jià)值。

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