響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取蓖麻堿工藝

邱 靖，陳永勝 ，穆莎茉莉，李國(guó)瑞

1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院;2內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)院;3內(nèi)蒙古自治區(qū)高校蓖麻產(chǎn)業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū)通遼028000

蓖麻堿是蓖麻中主要毒素之一，主要存在于蓖麻的莖葉和種子中，在幼嫩的子葉中含量較高，在植株不同的部位其含量有所不同，籽殼中含1.5%，幼嫩綠葉中含0.7% ～1.0%，種子中含0.1% ～0.2%，未脫毒的蓖麻餅中含 0.3% ～0.4%［1，2］。蓖麻堿為白色針狀或棱柱狀結(jié)晶體，其學(xué)名為3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮，分子式為 C8H8N2O2，分子量為164.17，熔點(diǎn)為201.5℃，在170～180℃、2667kPa 20S時(shí)有升華［3］。蓖麻堿是一種中性的生物堿，其水溶性呈中性，與酸反應(yīng)不易形成鹽，堿性溶液能使高錳酸鉀還原，同時(shí)還生成氫氰酸，因?yàn)楸吐閴A分子中含有氰基，其毒性很大，對(duì)人可引起嘔吐、惡心，嚴(yán)重時(shí)呼吸衰竭而死，對(duì)家禽毒性作用較強(qiáng)，是一種能導(dǎo)致甲狀腺腫大的潛在因子［4，5］。蓖麻堿有一定的殺蟲和鎮(zhèn)痛作用，對(duì)天幕毛蟲、小菜蛾、桃蚜等害蟲有不同程度的殺滅［6］。

超聲提取原理是利用超聲波在液體中產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械作用。當(dāng)大能量的超聲波作用于介質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的大氣壓的瞬間壓力破壞液體中植物細(xì)胞和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞內(nèi)溶物通過(guò)細(xì)胞膜的穿透能力，有助于蓖麻堿的釋放和溶出;超聲波使提取液不斷震蕩，有助于溶質(zhì)擴(kuò)散，縮短了破碎提取時(shí)間，同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，提高了有效成分的提取率和原料的利用率［7，8］。

本試驗(yàn)研究了以新鮮綠葉為提取原料，采用響應(yīng)面方法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿的工藝條件。目前國(guó)內(nèi)對(duì)蓖麻堿提取主要以蓖麻餅粕原料，然而至今還未有以新鮮的綠葉為原料的相關(guān)報(bào)道，在此方法的提取過(guò)程中工藝及處理方法有所不同。以綠葉為原料時(shí)，必須對(duì)綠葉中葉綠素進(jìn)行處理，避免葉綠素對(duì)蓖麻堿含量測(cè)定的干擾。而國(guó)內(nèi)對(duì)蓖麻堿的提取常用方法有回流提取法、微波提取法，以超聲波輔助提取蓖麻堿的工藝尚無(wú)報(bào)道。因此本文采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得最佳提取工藝參數(shù)能，夠取得較好的效果。此方法測(cè)定蓖麻葉、莖、中蓖麻堿的含量為今后的研究提供參考，從而為進(jìn)一步開發(fā)利用蓖麻堿提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通蓖6嫩葉(大田采樣);蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)樣品(實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)過(guò)高效液相色譜，核磁共振檢驗(yàn)純度為99.8%);甲醇、乙醇、三氯甲烷均為國(guó)產(chǎn)分析純;蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

VCX130型超聲波儀，美國(guó)Sonics＆Materials公司;紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;DHG-9240型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;TDL-5低速臺(tái)式大容量離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓖麻堿提取工藝

蓖麻葉→擦凈→去除葉脈→85%丙酮溶液浸泡(除葉綠素)→烘干→粉碎→溶劑超聲提取→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→蓖麻堿。

1.3.2 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照參考文獻(xiàn)［9］的方法精密稱取蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，并稀釋定容后得到1 mg/mL蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。從標(biāo)準(zhǔn)溶液中準(zhǔn)確吸取蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、200、400、600、800、1000 μL分別置100 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，使其濃度分別為 0、2、4、6、8、10 μg/mL的蓖麻堿溶液，室溫下靜置30 min;用紫外分光光度計(jì)，以甲醇為空白對(duì)照品，在波長(zhǎng)314 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，蓖麻堿濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程:Y=0．0593X-0．0044，R2=0.9991。

1.3.3 蓖麻堿提取率的計(jì)算

式中:C:提取液中蓖麻堿濃度;V:溶解蓖麻堿所用甲醇體積;m:蓖麻葉粉末質(zhì)量。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4.1 提取溶劑對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蓖麻葉粉末1 g，放入燒杯中，設(shè)定超聲溫度為60℃，時(shí)間為120 min，提取料液比為1∶20 g/mL，功率600 W。分別以甲醇、乙醇、三氯甲烷、水為提取溶劑。提取后離心，5000 rpm，離心20 min。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑后，用甲醇溶解并稀釋到刻度定容于100 mL容量瓶中，測(cè)定吸光度，確定最佳提取溶劑。

1.3.4.2 提取料液比對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蓖麻葉1 g，加甲醇進(jìn)行提取，以超聲功率為600 W、溫度為60℃，時(shí)間為120 min，在不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)的條件下進(jìn)行提取，同上1.3.4.1步驟操作，測(cè)定吸光度，確定最佳提取料液比。

1.3.4.3 超聲提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蓖麻葉1 g，以甲醇為提取溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL、超聲功率為600 W、溫度為60℃，在不同提取時(shí)間(30、60、90、120、150 s)的條件下進(jìn)行提取。同上1.3.4.1操作測(cè)定吸光度，確定最佳超聲時(shí)間。

1.3.4.4 超聲提取溫度對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取蓖麻葉1 g，以甲醇作為溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL、超聲功率600 W、在不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)的條件下提取120 min。同上1.3.4.1操作，測(cè)定吸光度，確定最佳超聲溫度。

1.3.4.5 超聲提取功率對(duì)提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1 g蓖麻葉，以甲醇為溶劑，提取料液比為1∶20 g/mL，超聲溫度為60℃，時(shí)間為 120 min，在不同超聲功率(400、500、600、700、800 W)的條件下進(jìn)行提取。同上1.3.4.1操作，測(cè)定吸光度，確定最佳超聲功率。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面設(shè)計(jì)［10］，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蓖麻堿提取率為響應(yīng)值Y，選出影響最顯著的因素:料液比、超聲時(shí)間、超聲功率，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑對(duì)蓖麻堿提取率的影響分析

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 1 Level and code of response surface experiments

圖1 提取溶劑(甲醇、乙醇、三氯甲烷、水)對(duì)蓖麻堿提取率的影響Fig.1 Effects of extraction solvent(methanol，alcohol，chloroform，H2O)on the extraction yield of ricinine

由圖1可知，在相同提取條件下，三氯甲烷為溶劑所得到的蓖麻堿提取率為最高;而以甲醇為提取溶劑所到的蓖麻堿提取率略低于三氯甲烷;乙醇為提取溶劑所得到的蓖麻堿提取率低于三氯甲烷;以水為提取溶劑所得到的蓖麻堿提取率最低。因三氯甲烷是有毒氣體，且甲醇提取率略低于三氯甲烷，故選擇甲醇最適宜。

2.1.2 提取料液比對(duì)蓖麻堿提取率的影響分析

圖2 料液比對(duì)蓖麻堿提取率的影響Fig.2 Effects of ratio of sample to solvent on extraction yield of ricinine

由圖2可知，料液比為1∶20 g/mL時(shí)，蓖麻堿提取率達(dá)到最高。蓖麻堿提取率隨著提取溶劑的增加而增加，料液比增加，細(xì)胞內(nèi)外濃度差增加，內(nèi)擴(kuò)散速度增加，有利于蓖麻堿的溶出。但當(dāng)溶劑用量達(dá)到一定程度時(shí)，蓖麻堿的提取率開始減小，此時(shí)如果繼續(xù)增加提取溶劑的用量，提取溶劑過(guò)多，提取液濃度會(huì)隨之下降，提取率就會(huì)減小。因此提取料液比以1∶20 g/mL為最佳。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的影響分析

圖3 超聲時(shí)間對(duì)蓖麻堿提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on extraction yield of ricinine

由圖3可知，隨著超聲時(shí)間的增加，蓖麻堿的提取率也隨之增加，當(dāng)超聲時(shí)間為120 min時(shí)提取率達(dá)到最高。其原因是超聲波的空化效應(yīng)。空化效應(yīng)造成細(xì)胞壁的破壞，蓖麻堿等物質(zhì)向溶液中擴(kuò)散，蓖麻堿提取率此時(shí)達(dá)到最高值。因此超聲時(shí)間為120 min為最佳提取。

2.1.4 超聲提取溫度對(duì)蓖麻堿提取率的影響

圖4 超聲波溫度對(duì)蓖麻堿提取率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic temperature on extraction yield of ricinine

圖5 超聲波功率對(duì)蓖麻堿提取率的影響 Effects of ultrasonic power on extraction yield of ricinine

由圖5可知，隨著超聲功率的增加，蓖麻堿的提取率增加，當(dāng)功率增加至600 W時(shí)，蓖麻堿的提取率達(dá)到最大值。而后又隨超聲功率的增加，蓖麻堿提取量隨之緩慢減少。因此，超聲功率為600 W為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程及方差分析

CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2，利用Design Expert 8軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到蓖麻堿提取率與各因素變量的二次回歸方程:

表2 CCD實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of CCD tests

表3 回歸方程模型方差分析Table 3 Analysis variance for regression equation model

注:＊＊P ＜0.001，very significant;*P ＜0.050，statistical significance;P＞0.050 non-significant。

由回歸方程模型方差分析表3可知，模型P＜0.0001，回歸模型極顯著。模型中一次項(xiàng)x3極顯著，x1、x2顯著;互交項(xiàng) x1x2顯著;二次項(xiàng)極顯著;結(jié)果表明，各因素對(duì)蓖麻堿提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)P=0.4856＞0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9858，說(shuō)明模型擬合程度良好，該模型可以較好的分析超聲法提取蓖麻堿提取率。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

通過(guò)響應(yīng)面圖可以直觀的看出各因素和各因素之間的交互作用對(duì)蓖麻堿提取率的影響，根據(jù)回歸方程做響應(yīng)面三維圖，比較響應(yīng)面三維圖可看出，在所選范圍之內(nèi)存在著極值，即為響應(yīng)面最高點(diǎn);等高線的形狀反映交互作用的大小，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形則表示兩因素交互作用顯著。比較3組響應(yīng)面及等高線分析圖可知:超聲時(shí)間和料液比對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用極顯著;其次超聲功率和超聲時(shí)間、料液比和超聲功率對(duì)蓖麻堿提取率對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用顯著。

2.2.3 提取工藝條件的確定與驗(yàn)證

提取工藝的優(yōu)化與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證為確定超聲波提取靈芝的最佳工藝參數(shù)，對(duì)擬合的回歸方程分別求3個(gè)變量的一階偏導(dǎo)，并令其值為0，可得到個(gè)因素的編碼值:x1=0.99，x2=-0.57，x3=0.21，轉(zhuǎn)換后得到最佳提取工藝條件為:超聲時(shí)間103.03 min、超聲功率621.05 W、料液比1∶25 g/mL，理論預(yù)測(cè)提取率為2.65‰。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿工藝結(jié)果的可靠性，根據(jù)得到的優(yōu)化條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)平均值為2.63‰，與預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.02‰。說(shuō)明該方程與實(shí)驗(yàn)情況擬合很好，響應(yīng)面法對(duì)蓖麻堿超聲波提取工藝的優(yōu)化是可行的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面分析法應(yīng)用于優(yōu)化超聲波提取蓖麻堿的條件。回歸方程模型方差分析結(jié)果表明超聲時(shí)間和料液比對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用極顯著;其次超聲功率和超聲時(shí)間、料液比和超聲功率對(duì)蓖麻堿提取率對(duì)蓖麻堿提取率的交互作用顯著，這3個(gè)因素對(duì)蓖麻堿提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面的回歸方程模型方差分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明此方法可行。所得超聲波法提蓖麻堿的最佳工藝為:以甲醇為提取溶劑，超聲時(shí)間103.03 min、超聲功率621.05 W、料液比1∶25 g/mL，蓖麻堿的理想預(yù)測(cè)值為 2.65‰，驗(yàn)證值為2.63‰，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.02‰。

1 Wen YM(溫燕梅)，F(xiàn)eng YF(馮亞非)，Zheng MZ(鄭明珠)，et al.Extraction and content of the ricinine for different parts of Ricinus communis.Agrochemicals，2008，47:584-606.

2 Zheng C(鄭成)，Xu LZ(許麗珠)，Gao XM(高曉明)，et al.Study on the extraction，purification，and recomposition of the ricinine and its insecticidal effects.Nat Prod Res Dev，2007，19:785-790.

3 Zhang XH(張小紅)，Li CL(李翠麗)，Yu JJ(于俊杰)，et al.Separation and determination of ricinine from Ricinus Semen.Chin J New Drugs，2011，20:1741-1744.

4 Yuldashev PKh.Ricinine and its transformation.Chem Nat Comp，2001，27:274-275.

5 Jiang XH，Song GQ.The comprehensive development and utilization of castor bean meal.J Zhongkai Agrotech College，2001，14:54-59.

6 Zhao ZL(趙增林)，Zhao W(趙偉)，Zhang HY(張海悅)，et al.Biological activity of ricinine.China Brew，2009，207(6):13-14.

7 Park SY，Chang SY，Oh OJ，et al.Nor-oleanene type triterpene glycosides from the leaves of Acanthopanax Japonicas.Phytochemistry，2002，59:379-384.

8 Wei LY，Wang JH，Zheng XD，et al.Studies on the extracting technical conditions of inulin from Jerusalem artichoke tubers.J Food Eng，2007，79:1087-1093.

9 Xu WQ(徐文清)，Chen A(陳艾)，Zhuang XL(莊湘蓮)，et al.Quantity determination of ricinine in Castor Pomace by ultroviolet spectrometry method.China Oil，2001，26(2):45-46.

10 Gupta S，Manohar CS.An improved response surface method for the determination of failure probability and importance measures.Structural Safety，2004，26:123-132.