正交試驗(yàn)法優(yōu)選復(fù)方四參顆粒劑的提取工藝

陳文娟，胡道德

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院，上海市 200080

復(fù)方四參顆粒劑由太子參、丹參、南沙參、苦參等9味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱活血、養(yǎng)心安神之效。臨床上主要應(yīng)用于病毒性心肌炎。中醫(yī)學(xué)上認(rèn)為病毒性心肌炎為虛實(shí)相兼之證，虛以氣陰兩虛為主，實(shí)以瘀熱交阻常見(jiàn)。復(fù)方四參顆粒劑的臨床療效顯著，對(duì)癥狀的改善尤為明顯;同時(shí)，對(duì)病毒性心肌炎后心律失常的控制也有較好的療效。病毒性心肌炎所致的各類心律失常是臨床治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)?？剐穆墒СＮ魉幘哂酗@著的電生理特性，但作用單一，并不完全符合病毒性心肌炎的病理生理特點(diǎn)，部分患者療效欠佳，而且有嚴(yán)重的副作用，如抑制心臟正常生理功能、誘發(fā)更嚴(yán)重的心律失常等。復(fù)方四參顆粒劑治療病毒性心肌炎在我院取得了很好的療效［1］。

丹酚酸B是丹參中抗病毒性心肌炎的活性成分，也是復(fù)方四參顆粒劑中的主要成分。為了提高丹酚酸B的得率，我們用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響丹酚酸B的提取條件如提取次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量等進(jìn)行研究，優(yōu)選最佳提取工藝，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司);AL104電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司);SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科技儀器設(shè)備有限公司);W2010數(shù)控恒溫浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司);DW調(diào)熱電熱器(上海平環(huán)燃燒設(shè)備工程技術(shù)有限公司)。

1.2 試劑

甲醇為色譜純;磷酸為分析純;水為超純水;太子參、丹參、南沙參、苦參等藥材購(gòu)于上海萬(wàn)仕城國(guó)藥制品有限公司;丹酚酸B對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所，供含量測(cè)定用(批號(hào)111562-201110)。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇藥材加水量(A)、煎煮次數(shù)(B)、煎煮時(shí)間(C)作為考察因素。本實(shí)驗(yàn)采用L9(34)正交表安排實(shí)驗(yàn)。以丹酚酸B含量和干膏得率為指標(biāo)對(duì)復(fù)方四參顆粒劑的提取工藝進(jìn)行優(yōu)選。因素水平表見(jiàn)表1。

2.2 樣品提取液的制備

按正交表的實(shí)驗(yàn)安排，依處方比例稱取各味藥材，加水浸泡過(guò)夜，煎煮、合并提取液，離心取上清液，上清液濃縮成流浸膏，調(diào)整流浸膏的密度在1.15～1.2之間，得樣品提取液。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal design

2.3 丹酚酸B含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件［2］

色譜柱:C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%磷酸溶液;檢測(cè)波長(zhǎng):286 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:25℃;理論板數(shù):61367;進(jìn)樣體積:10 μL。

2.3.2 供試品溶液制備

取提取濃縮液0.1 mL，加75%甲醇0.9 mL，混勻，離心，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取丹酚酸B對(duì)照品0.4587 mg至25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.018 mg/L丹酚酸B對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.4 陰性對(duì)照溶液制備

按處方比例稱取除丹參外的其他藥材，按照與供試品相同的方法制備陰性對(duì)照液。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取對(duì)照品溶液 5、10、15、20、30 μL 進(jìn)樣，記錄峰面積，以丹酚酸B面積對(duì)進(jìn)樣量線性回歸?；貧w方程為 A=7139．6C-28．398(R2=1.0000)，結(jié)果表明，丹酚酸B在0.92～5.4 μg線性良好。

2.4 干膏得率的測(cè)定［3］

精密吸取提取液7 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h至恒重，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定質(zhì)量，計(jì)算干膏得率。

2.5 丹酚酸B含量測(cè)定

分別吸取供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算丹酚酸B的含量。供試品及陰性對(duì)照溶液色譜圖見(jiàn)圖1。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。方差分析見(jiàn)表3、4。

2.6 最佳提取工藝的確定

表2中，直觀分析和效應(yīng)曲線圖結(jié)果表明，以干膏得率為指標(biāo)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3，各影響大小為C＞B＞A，即提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞加水量，最佳提取工藝為A3B1C3，次優(yōu)工藝為A2B2C3;以丹酚酸B含量為指標(biāo)，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，各影響大小為B＞A＞C，最佳提取工藝為 A3B2C1，次優(yōu)工藝為A2B2C3。由此得出最優(yōu)工藝為A2B2C3。丹酚酸B對(duì)熱不穩(wěn)定，隨著煎煮時(shí)間的增加，丹酚酸B含量減少，綜合以上分析以及節(jié)能考慮，確定復(fù)方四參顆粒劑的水提工藝8倍量水，提取2次，第一次時(shí)間為2 h，第二次時(shí)間為1 h。

圖1 對(duì)照品和復(fù)方四參顆粒劑的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of reference substances and Fufang Sishen granular formulation

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

表3 干膏得率方差分析Table 3 Results of analysis of variance of dry extract

F0.05(2，2)=19，F(xiàn)0.01(2，2)=99

表4 丹酚酸B含量方差分析Table 4 Results of analysis of variance of salvianolic acid B

2.7 最佳工藝的驗(yàn)證

平行稱取3份處方藥材，按照最佳工藝提取并制備相應(yīng)的樣品，測(cè)定干膏得率、丹酚酸B含量。結(jié)果表明，其平均干膏得率為16.58%，丹酚酸B的平均含量為22.42 mg。驗(yàn)證結(jié)果與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

復(fù)方四參顆粒劑是醫(yī)院制劑，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中證明其療效顯著，但是一直沒(méi)有具體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。太子參為本方君藥，但其所含化學(xué)成分無(wú)含量測(cè)定對(duì)照品，無(wú)法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。選用丹參中的丹酚酸B為含量測(cè)定指標(biāo)成分，其含量測(cè)定方法成熟、可靠，可以為復(fù)方四參顆粒制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

根據(jù)文獻(xiàn)［4，5］和預(yù)試驗(yàn)，影響復(fù)方提取工藝效果的主要因素是溶劑用量、煎煮次數(shù)和煎煮時(shí)間等。對(duì)溶劑的選擇是依據(jù)藥材中有效成分都溶于水的性質(zhì)和臨床使用方式多為水煎服的特點(diǎn)。采用水煎煮法提取，通過(guò)正交設(shè)計(jì)綜合考慮各因素，結(jié)果經(jīng)直觀分析表明:最佳水提取工藝為加8倍量的水，提取2次，每次2 h，但是丹酚酸B為熱不穩(wěn)定成分，故煎煮時(shí)間增加，其含量會(huì)有所下降，故改為第一次2 h，第二次1h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果與正交試驗(yàn)相一致，表明該工藝穩(wěn)定、可行。

丹酚酸B具有很強(qiáng)的抗氧化作用，能清除氧自由基［6］、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)心臟具有較好的保護(hù)作用，但是丹酚酸B對(duì)熱不穩(wěn)定，長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，含量會(huì)有所降低。為保證有效成分的提取率，在對(duì)提取液的濃縮過(guò)程中，需要采用減壓濃縮。

1 Wei QH(魏強(qiáng)華)，Shi YY(石蘊(yùn)玉)，Shen BS(沈博生)，et al.Clinical study on Fufang Sishen decoction in treating arrhythmia after virus myocarditis.J Chin Integr Med(中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào))，2004，2:97-99.

2 Yao HJ(姚慧娟)，Hu DD(胡道德)，Jin J(金劍)，et al.Determination of verbascoside and salvianolic acid B in Linqihuangban granules by HPLC gradient elution method.Chin J New Drugs Clin Rem(中國(guó)新藥與臨床雜志)，2010，29:123-126.

3 Ji QY(季巧遇)，Li YG(李詒光)，Liu XH(劉旭海)，et al．Optimization of extraction technology of Jianwei Xiaoshi orally disintegrating tablet by orthogonal test.Chin J Exp Tradit Med Form(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2011，17:512-15.

4 Du ZL(杜中良)，Cheng ZT(程振田).Optimization of the extraction technology of salvianolic acid B from salvia miltiorrhiza by orthogonal experiment.China Pharm(中國(guó)藥房)，2010，21:2911-2912.

5 Li SL(李紹林)，Zhang JJ(張建軍).Optimization of extracting technology of Salviae miltiorrhizae.Chin J Exp Tradit Med Form(中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志)，2011，17:45-47.

6 Wang SP(王舒平)，Wang YY(王艷艷)，Yin CN(尹彩娜)，et al.Effect of salvianolic acid B on digestive system ROS level in high sugar dietary mice.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā))，2009，21:948-951.