腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用*

盧 芳， 周伶萍， 吳慶國， 劉艷玲， 徐紅蕾

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用*

盧 芳， 周伶萍， 吳慶國， 劉艷玲， 徐紅蕾△

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

目的探討腺苷A2A受體激動(dòng)劑對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的急性肺損傷(ALI)小鼠的作用。方法采用LPS(10 mg/kg)氣管內(nèi)注射6 h后的ALI小鼠模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組、ALI組、CGS21680治療組和CGS21680對(duì)照組。測定各組6 h后肺濕重/干重比值(W/D)。比色法測定各組肺組織中髓過氧化物酶(MPO)活性。Western blotting分析各組肺組織中細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子1(VCAM-1)的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組小鼠血清中單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)的濃度。觀察各組肺組織病理改變。結(jié)果ALI組肺W/D、MPO活性、ICAM-1及VCAM-1表達(dá)和MCP-1濃度均較對(duì)照組顯著升高。CGS21680治療組前述各項(xiàng)指標(biāo)較ALI組有顯著下降。CGS21680組較對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)無顯著差異。肺組織病理顯示，ALI組可見肺間質(zhì)明顯充血水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞。CGS21680治療組可顯著改善肺組織的病理變化。結(jié)論腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680可明顯減輕LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)及肺組織水腫，提示腺苷A2A受體激動(dòng)劑在急性肺損傷中具有保護(hù)作用。

急性肺損傷； 脂多糖類； 受體，腺苷A2A

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是各種直接或間接肺損傷因素導(dǎo)致的急性呼吸衰竭，嚴(yán)重者可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，臨床上表現(xiàn)為肺部彌漫性滲出和難以糾正的低氧血癥，并排除左心衰竭導(dǎo)致的肺充血水腫[1]。目前大量研究表明，體內(nèi)失控性釋放的大量促炎介質(zhì)如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、黏f附分子、趨化因子以及抗炎介質(zhì)如白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)的相對(duì)減少與ALI的發(fā)病密切相關(guān)[2]。其死亡率約為35%～60%[1]，治療手段有限。腺苷是一內(nèi)源性嘌呤核苷，于1927年在心臟的研究中發(fā)現(xiàn)[3]。生理狀態(tài)下細(xì)胞外的腺苷濃度較低，濃度為納摩爾級(jí)，但在炎癥或缺血缺氧組織中，其濃度能夠增加到生理濃度的100倍[4]。腺苷是通過特異性的細(xì)胞表面受體發(fā)揮作用，研究已證實(shí)腺苷受體包括A1、A2A、A2B、A3四種亞型，均為G蛋白偶聯(lián)受體，不同的受體發(fā)揮其不同的生理作用[5]。其中，腺苷A2A受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脾臟、白細(xì)胞以及血小板，在肺內(nèi)也有中等量表達(dá)。目前已有大量研究認(rèn)為，腺苷A2A受體的激活與抗炎作用密切相關(guān)。但腺苷A2A受體在急性肺損傷中的研究較少?；诖?，我們建立了脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型，研究腺苷A2A受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)小鼠急性肺損傷的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠24只，7～14周齡，體重16～25 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品與試劑 大腸桿菌LPS(O55：B5)購于Sigma，CGS21680購于Tocris,髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測定試劑盒購于南京建成生物工程公司，小鼠血清中單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)ELISA試劑盒以及細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)抗體和血管黏附分子1(vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)抗體均購自武漢博士德公司，β-actin抗體購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

2方法

2.1動(dòng)物模型建立與分組 采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法將小鼠分為4組，每組6只小鼠。ALI組：氣管內(nèi)注入LPS 10 mg/kg后，腹腔內(nèi)注入等體積載體溶液(DMSO+NS)。CGS21680治療組：氣管內(nèi)注入LPS后，腹腔內(nèi)注入CGS21680 (DMSO溶解后用NS稀釋)0.5 mg/kg。CGS21680對(duì)照組：在氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水后，腹腔注射CGS21680 0.5 mg/kg。生理鹽水對(duì)照組，氣管內(nèi)注入等體積的生理鹽水后，腹腔內(nèi)注入等體積的載體溶液。各組小鼠均在致傷6 h后處死。

2．2肺濕重/干重比值(wet weight/dry weight，W/D)測定 取右上肺稱肺濕重后，將肺組織置于70 ℃烤箱內(nèi)烘干72 h至完全脫水，稱量肺干重，計(jì)算肺W/D，以估計(jì)肺組織水腫程度。

2．3MCP-1的測定 各組動(dòng)物致傷6 h后，經(jīng)眼眶采血，留取血清置-80 ℃冰箱凍存。采用ELISA測定血清中MCP-1的含量。

2．4測定中性粒細(xì)胞MPO的活性 通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測定此產(chǎn)物的生成量，從而推算出MPO的活性。

2．5肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的測定 取小鼠肺組織，勻漿，分離細(xì)胞膜漿蛋白，測定蛋白濃度，在12%SDS-PAGE中分離相等量蛋白，電轉(zhuǎn)染到PVDF膜。Western blotting分析ICAM-1和VCAM-1的表達(dá)，以β-actin抗體作為對(duì)比。

2．6病理學(xué)檢查 留取右下肺，固定于10%甲醛液中，進(jìn)行石蠟切片及常規(guī)HE染色，觀察光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)變化。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。各組均數(shù)數(shù)據(jù)先行方差齊性檢驗(yàn)。樣本均數(shù)的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1CGS21680對(duì)肺含水量的影響

ALI組肺W/D比值較NS對(duì)照組明顯升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明出現(xiàn)肺水腫。CGS21680治療組較ALI組有顯著降低，但仍高于NS對(duì)照組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NS對(duì)照組與CGS21680對(duì)照組W/D值無顯著差異，提示CGS21680能減少急性肺損傷中肺的含水量，見表1。

2CGS21680對(duì)血清中MCP-1的影響

從表1可以看出，ALI組較NS對(duì)照組MCP-1的水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低(P<0.05)，但仍高于NS對(duì)照組，CGS21680對(duì)照組與NS對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3CGS21680對(duì)肺組織中MPO蛋白的影響

從表1可以看出，ALI組較NS對(duì)照組MPO的水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低，但仍高于NS對(duì)照組(P<0.05)，CGS21680對(duì)照組與NS對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4CGS21680對(duì)肺組織中的ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的影響

從圖1及表2可以看出，ALI組較NS對(duì)照組ICAM-1和fVCAM-1蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，CGS21680治療組較ALI組有顯著降低(P<0.05)，CGS21680對(duì)照組與NS對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1腺苷受體激動(dòng)劑CGS21680對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠炎癥的影響

Table 1. Effect of adenosine A2Areceptor agonist CGS21680 on inflammation of acute lung injury (ALI) mice induced by lipopolysaccharide(LPS)(mean±SD.n=6)

GroupLungW/DMCP-1(ng/L)MPOactivity[U/(gwettissue)]NS4.20±0.9039.51±22.571.35±0.35ALI5.57±0.97*259.00±110.75*2.56±0.79*CGS21680+LPS5.12±0.64#156.47±84.09#2.01±0.58#CGS216804.23±0.6524.93±12.541.48±0.36

*P<0.05vsNS；#P<0.05vsALI.

Figure 1. Effects of CGS21680 on VCAM-1 and ICAM-1 protein expression in lung tissues detected by Western blotting.

圖1CGS21680對(duì)VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

表2CGS21680對(duì)VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

Table 2. Effects of CGS21680 on VCAM-1 and ICAM-1 protein expression in lung tissues(mean±SD.n=6)

GroupVCAM-1ICAM-1NS290.43±10.89289.34±14.81ALI710.55±46.14*580.10±15.58*CGS21680+LPS520.53±36.28#383.78±14.73#CGS21680298.43±16.16293.86±13.66

*P<0.05vsNS；#P<0.05vsALI.

5CGS21680對(duì)肺組織病理變化的影響

光鏡下見NS對(duì)照組(圖2A)和CGS21680組(圖2C)肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及支氣管腔未見炎癥細(xì)胞及滲出物。ALI組(圖2B)可見點(diǎn)、片狀出血，大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡間隙邊緣有輕度的透明膜存在，顯示明顯的炎癥和輕度的肺水腫現(xiàn)象，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄。CGS21680治療組(圖2D)較模型組上述病理變化有明顯改善。

Figure 2. Effect of adenosine A2Areceptor agonist CGS21680 on lung histopathological changes in ALI mice induced by LPS(HE staining,×400).A：NS group；B：ALI group；C：CGS21680 group；D：CGS21680+LPS group.

圖2CGS21680對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織病理學(xué)的影響

討 論

ALI/ARDS是由各種肺內(nèi)或肺外因素導(dǎo)致的肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損[6]，引起肺部彌漫性的滲出，肺泡蛋白沉積，導(dǎo)致臨床上難以糾正的嚴(yán)重的呼吸窘迫。目前已有大量研究表明急性肺損傷是由于機(jī)體炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致的臨床綜合征，主要以促炎因子明顯升高，抑炎因子的下降以及凝血纖溶系統(tǒng)失衡為特征。參與這些炎癥反應(yīng)的細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。其中中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等在急性肺損傷中發(fā)揮了重要作用[2]。但我們的前期研究認(rèn)為毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是敗血癥中炎癥反應(yīng)的主要靶點(diǎn)[7]。所以我們推測在急性肺損傷中，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后分泌大量黏附分子(ICAM-1和VCAM-1)、趨化因子(MCP-1)等，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向炎癥部位聚集，在敗血癥導(dǎo)致的急性肺損傷中可能發(fā)揮更為重要的作用，

腺苷來源于腺嘌呤核苷酸的分解代謝，在機(jī)體缺血缺氧、急性或者慢性炎癥情況下大量生成。腺苷通過結(jié)合腺苷受體發(fā)揮作用。腺苷受體有A1、A2A、A2B、A3四種亞型，其中腺苷A2A受體基因定位于22q11．2，主要通過偶聯(lián)霍亂毒素敏感的GS蛋白活化腺苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度發(fā)揮作用。腺苷A2A受體分布廣泛，在紋狀體、心、肺、肝、腎等組織均有表達(dá)，而在細(xì)胞上，如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，也呈高水平表達(dá)。Kumar等[8]研究認(rèn)為，腺苷A2A受體活化能夠抑制中性粒細(xì)胞黏附血管內(nèi)皮并向炎癥組織浸潤，抑制氧自由基的形成，抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化，抑制單核巨噬細(xì)胞的增殖分化以及炎癥因子的分泌而起到抗炎作用。大量研究證實(shí)，腺苷A2A受體的激活能明顯減輕敗血癥的臟器損害，在胃腸炎、急性肝炎、腎小球腎炎方面也發(fā)揮有力的保護(hù)作用，但其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用既有保護(hù)作用又能加重?fù)p傷。

CGS21680是腺苷A2A受體的高效激動(dòng)劑。在對(duì)鼠的一系列體內(nèi)研究中，CGS21680被證實(shí)能減輕通氣相關(guān)性肺損傷[9]，能預(yù)防創(chuàng)傷/失血性休克導(dǎo)致的肺損傷[10]，能減輕角叉菜膠誘導(dǎo)的胸膜炎模型中的肺損傷[11]。此外，腺苷A2A受體激活還能增加小鼠肺泡中液體的清除[5]。但在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷中，在急性肺損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能方面，關(guān)于腺苷A2A受體的影響研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用LPS氣管內(nèi)注入，結(jié)果顯示LPS組相比于生理鹽水對(duì)照組，ICAM-1、VCAM-1以及MCP-1的表達(dá)明顯升高，肺組織病理顯示肺組織中大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)水腫液積聚，間質(zhì)充血水腫，表明造模成功。CGS21680治療組能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠早期的ICAM-1、VCAM-1(間接反映毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷)以及MCP-1(反映急性炎癥過程中趨化因子的變化)的水平，降低中性粒細(xì)胞的肺組織浸潤(MPO活性間接反映中性粒細(xì)胞浸潤程度)，減少肺泡內(nèi)液體的積聚(間接反映毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械性損傷)。肺組織病理同樣顯示CGS21680治療組肺損傷程度較LPS組明顯減輕。LPS是通過結(jié)合Toll樣受體4，激活NF-κB途徑導(dǎo)致的系統(tǒng)性炎癥綜合征。楊紅等[12]研究認(rèn)為LPS是通過損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致急性肺損傷。Murphree等[13]在體外腹膜內(nèi)巨噬細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，在LPS刺激細(xì)胞后，細(xì)胞表面腺苷A2A受體數(shù)量增加約290倍，通過腺苷A2A激動(dòng)劑ATL146e干預(yù)后，TNF-α釋放明顯減少，提示NF-κB途徑能誘導(dǎo)腺苷A2A受體的生成。所以我們推測，激活腺苷A2A受體是通過抑制NF-κB途徑，抑制毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而抑制中性粒細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的促炎效應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎及肺保護(hù)作用，但其具體的機(jī)制需要在以后的研究中進(jìn)一步明確。值得注意的一點(diǎn)是，腺苷A2A受體的激活是過度炎癥的機(jī)體負(fù)反饋調(diào)節(jié)，其過度激活可能導(dǎo)致機(jī)體的免疫保護(hù)作用受到限制，繼而導(dǎo)致入侵病原體的擴(kuò)散，最終加重肺損傷。故腺苷A2A受體的作用需要在以后的研究中進(jìn)一步明確。

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ProtectiveeffectofadenosineA2AreceptoragonistCGS21680onmicewithlipopolysaccharideinducedacutelunginjury

LU Fang, ZHOU Ling-ping, WU Qing-guo, LIU Yan-ling, XU Hong-lei

(DepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:xfhl2000@163.com)

AIM: To investigate the effect of adenosine A2Areceptor agonist on mice with acute lung injury (ALI) induced by lipopolysaccharide (LPS).METHODSThe mouse model of ALI was established by intraperitoneal injection of LPS. The mice were randomly divided into saline control group, ALI group, CGS21680 treatment group and CGS21680 control group. Six hours after LPS injection, the mice were sacrificed. The ratio of pulmonary wet weight to dry weight (W/D) was measured to assess the extent of pulmonary edema. Neutrophil infiltration was assayed by determining the myeloperoxidase(MPO) activity in lung tissues.The expression of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1(VCAM-1) was detected by Western blotting. The level of monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1) in the serum was examined by ELISA. The pathological changes of the lung were observed.RESULTSThe lung W/D, MPO activity, the expression of ICAM-1 and VCAM-1 intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and vascular cell adhesion molecule 1(VCAM-1)，and the concentration of MCP-1 in ALI group were significantly higher than those in control group. All indexes reduced significantly in CGS21680 treatment group as compared with ALI group. No statistical difference between CGS21680 group and control groups was observed. Marked pulmonary interstitial hyperemia, edema, and infiltration of a large number of inflammatory cells and red blood cells were observed in some alveolar space in ALI group. Treatment with CGS21680 greatly improved the pathological changes of the lung tissues.CONCLUSIONAdenosine A2Aagonist CGS21680 has a protective effect on mice with acute lung injury.

Acute lung injury; Lipopolysaccharides; Receptors,adenosine A2A

R563

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.029

1000- 4718(2013)04- 0739- 05

2012- 10- 15

2013- 03- 01

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LY12H01001)

△通訊作者 Tel： 0577-55579275; E-mail： xfhl2000@163.com