瑞舒伐他汀抑制C-反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)*

鐘鈞琳， 彭 隆， 羅艷婷， 劉金來

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 廣州510630)

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)不僅是一種炎癥標(biāo)志物和心血管疾病強(qiáng)有力預(yù)測(cè)因子，而且參與了從脂質(zhì)條紋形成到易損斑塊破裂所致急性冠脈綜合征的形成過程［1］。CRP 可通過減少一氧化氮(nitric oxide，NO)的釋放［2］、上調(diào)黏附分子的表達(dá)［3］、刺激平滑肌細(xì)胞增殖及遷移［4］、激活補(bǔ)體系統(tǒng)［5］等一系列生物學(xué)作用導(dǎo)致內(nèi)皮動(dòng)脈粥樣硬化。

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是內(nèi)皮細(xì)胞前體細(xì)胞，參與血管損傷后修復(fù)，維持血管壁完整性。EPCs 分為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞(early EPCs)和晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(late EPCs;又稱endothelial outgrowth cells，EOCs)。自1997 年Arasaha等［6］從人外周血中分離出內(nèi)皮祖細(xì)胞以來，大多數(shù)研究將能攝取乙?；兔芏戎鞍?ac-LDL)和結(jié)合荊豆凝集素(UEA-1)，并表達(dá)CD34、VEGFR2 和CD133 等抗原的一群細(xì)胞稱為EPCs。2000 年Lin等［7］從人外周血中成功分離培養(yǎng)出EOCs。EOCs 是一類能增殖并分化為成熟且有功能的血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞。Hur 等［8］發(fā)現(xiàn)EOCs 比早期EPCs 有更強(qiáng)的黏附能力，在體外血管形成能力上，EOCs 要顯著強(qiáng)于早期EPCs。

本課題擬研究CRP 對(duì)EOCs 旁分泌致炎因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白細(xì)胞介素8(interleukin-8，IL-8)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)情況的影響，以及探討他汀藥物瑞舒伐他汀對(duì)CRP 所致致炎因子的作用，進(jìn)一步提供CRP 致炎、致動(dòng)脈粥樣硬化的證據(jù)，為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 主要材料與試劑

淋巴細(xì)胞分離液購于MP Biomedicals;內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(endothelial basal medium-2，EBM-2)購于Lonza，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基生長因子套裝(EGM-2 singleQuot Kit Suppl ＆ Growth Factors)購于Clonetics;人纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)購于Millipore;重組人C 反應(yīng)蛋白CRP 購自Calbiochem;DiI-乙?；兔芏戎鞍?DiI-ac-LDL)購于Molecular Probe;FITC-荊豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-I)購于Sigma;FITC-CD14、FITC-CD34、PE-VEGFR2 和PC5-CD45 均購于BD，PE-CD133 購于Miltenyi;Trizol 試劑購于Invitrogen;逆轉(zhuǎn)試劑盒購于TaKaRa;熒光定量PCR 試劑盒購于TaKaRa;MCP-1 和VCAM-1 ELISA 試劑盒購于Bender;瑞舒伐他汀購于南京德寶公司。

2 方法

2.1 人臍血EOCs 的分離與培養(yǎng) 收集中山三院健康足月產(chǎn)孕婦臍帶血30 mL，所有血標(biāo)本的獲得均告知產(chǎn)婦，并簽署知情同意書。用PBS 緩沖液1∶1稀釋，鋪于淋巴細(xì)胞分離液表面，稀釋血與淋巴細(xì)胞分離液體積比為2 ∶1，形成清晰界面。800 × g 離心30 min，將白膜狀單個(gè)核細(xì)胞吸入另一管內(nèi)，PBS 清洗2 次后，用5%胎牛血清EGM-2 培養(yǎng)液重懸，接種于包被有纖維連接蛋白的6 孔板，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱(95%空氣)中孵育24 h 后用PBS 輕柔洗去未貼壁細(xì)胞并更換新鮮培養(yǎng)液。此后每3 d 更換全部培養(yǎng)液。待原代細(xì)胞生長匯合后傳代進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 EOCs 的鑒定

2.2.1 DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙熒光染色鑒定

取傳代后第2 代細(xì)胞與10 mg/L DiI-ac-LDL 置于37 ℃下孵育4 h，以2%多聚甲醛固定10 min，再加入10 mg/L FITC-UEA-1，37 ℃孵育1 h。熒光顯微鏡下觀察，DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙染色陽性的細(xì)胞即為正在分化的EOCs。

2.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定法 將傳代后第2 代細(xì)胞以0.25%胰酶消化后，制成106個(gè)細(xì)胞/L 單細(xì)胞懸液加入熒光標(biāo)記抗CD34、KDR、CD133、CD14 和CD45 抗體各5 μL，避光孵育30 min 后上機(jī)，流式細(xì)胞儀分析EOC 的CD34、KDR、CD133、CD14 和CD45表達(dá)。

2.3 細(xì)胞分組處理 取第3 ～6 代細(xì)胞分為3 組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。CRP 量效組:將CRP 不同濃度(0、5、10、25、50 mg/L)分別與EOCs 孵育。CRP 時(shí)效組:將50 mg/L CRP 分別與EOC 孵育不同時(shí)間(0、3、6、12 h)。瑞舒伐他汀量效組:將細(xì)胞用瑞舒伐他汀不同濃度(10-8mol/L，10-7mol/L，10-6mol/L)預(yù)孵育12 h，再加入CRP 50 mg/L 刺激?？瞻讓?duì)照不加任何試劑，陽性對(duì)照只加CRP 50 mg/L。

2.4 熒光定量PCR 檢測(cè) 分別收集各組細(xì)胞，按照Trizol 說明書提取各組細(xì)胞總RNA 后，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，cDNA 逆轉(zhuǎn)錄按試劑盒說明書進(jìn)行。以所逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，各靶基因PCR 引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)，由上海英濰捷基公司合成。IL-8 正義序列5'-AAACCACCGGAAGGAACCAT-3'，反義序列5'-CCTTCACACAGAGCTGCAGAAA-3';MCP-1 正義序列5'-CAGCCAGATGCAATCAATGC-3'，反義序列5'-GTGGTCCATGGAATCCTGAA-3';VCAM-1 正義序列5'-CAAATCCTTGATACTGCTCATC-3'，反義序列5'-TTGACTTCTTGCTCACAGC-3';ICAM-1 正義序列5'-CTCAGTCAGTGTGACCGCAGA-3'，反 義 序 列 5'-CCCTTCTGAGACCTCTGGCTTC-3';內(nèi)參照β-actin 正義序列5'-CAACTGGGACGACATGGAGAAA-3'，反義序 列 5'-GATAGCAACGTACATGGCTGGG-3'。使 用SYBR? Green 嵌合熒光法，按試劑盒進(jìn)行操作。95℃30 s 預(yù)變性后，95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個(gè)循環(huán)，最后95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s 融解。根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算mRNA 表達(dá)的相對(duì)量。

2.5 ELISA 檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)分組處理培養(yǎng)后收集上清液，步驟嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中MCP-1 和ICAM-1 表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次以上，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示。主要統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，正態(tài)分布數(shù)據(jù)組間差異性比較采用單因素方差分析，LSD 法進(jìn)行兩組間多重比較。采用SPSS 15.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EOCs 的鑒定

臍血分離獲得的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)約第4 ～6 d 開始出現(xiàn)梭形細(xì)胞，第6 ～8 d 左右形成若干個(gè)細(xì)胞集落，在15 ～20 d 左右各個(gè)集落相互融合呈橢圓形鋪路石樣排列(圖1A)。熒光顯微鏡觀察，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1 雙染色陽性的細(xì)胞為正在分化的EOCs(圖1D)。用流式鑒定法可見干細(xì)胞標(biāo)志CD34陽性率30.6%，CD133 陽性率5.97%，內(nèi)皮細(xì)胞系標(biāo)志KDR(VEGFR2)陽性率92.9%，而CD14 陽性率3.26%，CD45 陽性率2.96%，見圖2。

Figure 1. Morphoplogy and identification of the EOCs(×200). A:cobblestone-like cells;B:DiI-ac-LDL;C:FITC-UEA-1;D:merged.圖1 EPCs 細(xì)胞形態(tài)及熒光染色鑒定結(jié)果

Figure 2. Phenotyping of EOCs detected by flow cytometry.圖2 EOCs 流式鑒定結(jié)果

2 CRP 刺激EOCs 后炎癥 因子IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)

CRP(5、10、25 和50 mg/L)刺激EOCs 6 h 后，IL-8 mRNA 表達(dá)量分別為97%、98%、141% 和198%，MCP-1 mRNA 表達(dá)量分別為99%、116%、152% 和197%，VCAM-1 mRNA 表達(dá)量分別為102%、119%、133%和147%，ICAM-1 mRNA 表達(dá)量分別為102%、103%、130%和160%，在CRP 50 mg/L 刺激下四者的表達(dá)量均達(dá)高峰，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖3A。同時(shí)，我們用CRP 50 mg/L 分別刺激EOCs 3、6 和12 h，IL-8 mRNA 的表達(dá)量分別為227%、260% 和120%，MCP-1 mRNA 表達(dá)量分別為340%、180%和109%，VCAM-1 mRNA 表達(dá)量為152%、260%和102%，ICAM-1 mRNA 表達(dá)量為155%、173% 和127%，可見IL-8、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)量在CRP 刺激6 h達(dá)高峰，MCP-1 mRNA 表達(dá)量在CRP 刺激3 h 后達(dá)高峰，且與對(duì)照組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，見圖3B。

3 CRP 刺激EOCs 后MCP-1 和VCAM-1 蛋白表達(dá)

在CRP 為5、10、25 和50 mg/L 濃度下培養(yǎng)12 h，上清液中MCP-1 蛋白表達(dá)量分別為218.9 ng/L、240.2 ng/L、343.0 ng/L 和512.0 ng/L(對(duì) 照 組212.5 ng/L)，VCAM-1 蛋白表達(dá)量分別為34.8 ng/L、37.7 ng/L、48.5 ng/L 和61.2 ng/L(對(duì)照組34.5 ng/L)，其中50 mg/L 組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表1。同樣，EOCs 在CRP 50 mg/L 濃度刺激3、6 和12 h，上清液中MCP-1 蛋白表達(dá)量為346.8 ng/L、460.2 ng/L 和517.5 ng/L(對(duì)照組276.7 ng/L)，VCAM-1 蛋白表達(dá)量為31.8 ng/L、32.1 ng/L和45.8 ng/L(對(duì)照組30.5 ng/L)，其中CRP 刺激12 h 組與對(duì)照組比較兩者均有顯著差異(P ＜0.05)，見表2。

Figure 3. Effects of CRP on the expression of IL-8，MCP-1，VCAM-1 and ICAM-1 mRNA in EOCs. A:EOCs were treated with CRP at different concentrations (0，5，10，25 and 50 mg/L)for 6 h;B:EOCs were incubated with 50 mg/L CRP for different exposure time(0，3，6 and 12 h). Mean ± SD. n = 3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖3 CRP 對(duì)EOCs IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)的影響

表1 不同濃度CRP 刺激EOCs 后細(xì)胞上清液MCP-1 和VCAM-1 的變化Table 1. Supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with CRP at different doses(ng/L.Mean±SD.n=3)

表2 50 mg/L CRP 不同時(shí)間刺激EOCs 后細(xì)胞上清液MCP-1 和VCAM-1 的變化Table 2. Supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with 50 mg/L CRP at different time points(ng/L.Mean±SD.n=3)

4 瑞舒伐他汀下調(diào)CRP 所致的EOCs IL-8、MCP-1 、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)

以50 mg/L CRP 刺激6 h 為陽性對(duì)照，分別用不同濃度的瑞舒伐他汀(10-8、10-7和10-6mol/L)預(yù)孵育12 h 再加50 mg/L CRP 刺激6 h。與空白對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1 mRNA 表達(dá)量分別為205%、161%、268%和194%。隨著瑞舒伐他汀濃度增加(10-8、10-7和10-6mol/L)，各基因表達(dá)量均減少，IL-8 mRNA 表達(dá)量分別為165%、131%和66%;MCP-1 mRNA 表達(dá)量分別為155%、138%和94%;VCAM-1 mRNA 表達(dá)量分別為265%、208%和144%;ICAM-1 mRNA 表達(dá)量分別為190%、180%和126%。各基因在10-6mol/L組與陽性對(duì)照CRP 組比較表達(dá)量均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4。

5 瑞舒伐他汀下調(diào)CRP 刺激EOCs 所致的MCP-1和VCAM-1 蛋白表達(dá)

以50 mg/L CRP 刺激12 h 為陽性對(duì)照，分別用瑞舒伐他汀不同濃度(10-8、10-7和10-6mol/L)預(yù)孵育12 h 再加50 mg/L CRP 刺激12 h。陽性對(duì)照組細(xì)胞上清液中MCP-1 和VCAM-1 蛋白表達(dá)量分別為606 ng/L(對(duì)照組276.7 ng/L)和51.0 ng/L(對(duì)照組32.0 ng/L)。隨著他汀濃度增加，上清液中MCP-1蛋白表達(dá)量分別為559.6 ng/L、494.8 ng/L 和217.5 ng/L;VCAM-1 上清液蛋白表達(dá)量分別為46.8 ng/L，38.1 ng/L 和26.2 ng/L。各基因10-6mol/L 組與陽性對(duì)照CRP 組比較表達(dá)量均下降，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表3。

Figure 4. Effects of rosuvastatin on CRP-induced expression of IL-8，MCP-1，VCAM-1 and ICAM-1 in EOCs. EOCs were treated with different concentrations of rosuvastatin (10 -8，10 -7 和10 -6 mol/L)for 12 h，and then stimulated with 50 mg/L CRP.Maen±SD. n =3. * P＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs CRP group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs control.圖4 瑞舒伐他汀對(duì)CRP 誘導(dǎo)EOCs IL-8、MCP-1、VCAM-1和ICAM-1 mRNA 表達(dá)的影響

表3 瑞舒伐他汀對(duì)50 mg/L CRP 刺激后EOCs 細(xì)胞上清液MCP-1 和VCAM-1 變化的影響Table 3. Effects of rosuvastatin on supernatant MCP-1 and VCAM-1 levels in EOCs stimulated with 50 mg/L CRP(ng/L.Mean±SD.n=3)

討 論

CRP 是一種非特異性急性期反應(yīng)蛋白，是體內(nèi)炎癥反應(yīng)和組織損傷敏感性指標(biāo)之一，與冠心病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系。冠心病的始動(dòng)因素是內(nèi)皮損傷。Liang 等［9］發(fā)現(xiàn)，CRP 可通過臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜上CD32 受體引起轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 激活，使細(xì)胞VCAM-1 mRNA 及蛋白表達(dá)增高;又有報(bào)道CRP 可通過促進(jìn)晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products，AGEs)與內(nèi)皮細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for AGEs，RAGE)結(jié)合，促進(jìn)MCP-1 表達(dá)增加，引起單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞募集、趨化至血管內(nèi)皮細(xì)胞處［10］。而RAGE 與配體相互作用還可激活NF-κB 途徑，導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38 有絲分裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)和PKC 從而傳遞炎癥信號(hào)，上調(diào)一系列炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)［11］。而IL-8 和MCP-1 可引起單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞募集、趨化至血管內(nèi)皮細(xì)胞處［12］，同時(shí)VCAM-1 和ICAM-1可增加單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附。而單核細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)皮下后，可分化成血管內(nèi)膜巨噬細(xì)胞，脂質(zhì)攝取轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞堆積在血管壁上，導(dǎo)致脂肪條紋加速形成，啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化過程［9］。EPCs 是內(nèi)皮細(xì)胞的前體，它在血管新生和維持內(nèi)皮功能完整中具有重要作用，有文獻(xiàn)報(bào)道［13-14］，CRP 可直接影響EPCs 的增殖、遷移、黏附功能，促進(jìn)其凋亡，損害其再內(nèi)皮化功能，降低血管再生潛能。研究發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血EPCs 的數(shù)量、生物學(xué)功能均有顯著下降［15］。故本課題主要研究CRP 對(duì)EOCs 是否存在致炎作用，通過體外培養(yǎng)EOCs，發(fā)現(xiàn)不同濃度和不同時(shí)間的CRP 刺激可促進(jìn)EOCs 分泌炎癥因子IL-8、MCP-1、VCAM-1 和ICAM-1，這一發(fā)現(xiàn)為解釋炎癥和心血管疾病之間的關(guān)系提供了依據(jù)，然而具體的機(jī)制尚未清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道［16］，MCP-1 能通過p35依賴的線粒體途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

他汀類藥物是一類HMG-CoA 還原酶抑制劑，不僅具有降脂作用，還有明顯改善血管內(nèi)皮功能、抑制炎癥的作用。Chen 等［17］報(bào)道，高脂飲食能導(dǎo)致小鼠炎癥相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙，而阿托伐他汀能下調(diào)體內(nèi)CRP 和IL-6 水平改善炎癥，并下調(diào)內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)及上調(diào)NO 水平而改善內(nèi)皮功能。楊冰等［18］發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可通過提高循環(huán)中EPCs數(shù)量，改善EPCs 的增殖、遷移、黏附功能，增加EPCs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力。那么他汀對(duì)于CRP 所致EOCs 炎癥因子情況是否存在影響?本研究首次發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀能明顯降低CRP 所致EOCs 分泌炎癥因子的水平，這進(jìn)一步支持了Chang 等［19］的研究:辛伐他汀能抑制CRP 所致的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、MCP-1 和IL-8 分泌，抑制CRP 在血管炎癥發(fā)生過程中的作用。但瑞舒伐他汀調(diào)節(jié)CRP 刺激EOCs 所致炎癥的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

總之，本研究表明CRP 可作為致炎因子刺激晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌趨化因子(IL-8、MCP-1)及黏附分子(VCAM-1、ICAM-1);瑞舒伐他汀能顯著抑制CRP刺激EOCs 所致的炎癥因子(IL-8、MCP-1)和黏附分子(VCAM-1、ICAM-1)的分泌，從而為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供了新的靶點(diǎn)。

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