殺菌/通透性增加蛋白基因Glu216Lys 多態(tài)性與中國(guó)漢族人群炎癥性腸病無(wú)關(guān)

楊慶帆， 陳白莉， 張青森， 何 瑤， 陳旻湖， 曾志榮

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州510080)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是胃腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn disease，CD)［1-2］。近年來(lái)，炎癥性腸病在亞洲的發(fā)病率顯著升高，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前認(rèn)為IBD 是一種復(fù)雜的多基因疾病，遺傳易感性在其發(fā)病中起著重要作用;然而，在目前研究發(fā)現(xiàn)的眾多與IBD 發(fā)病、臨床特征、藥物療效相關(guān)的基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)中，大部分SNP 與歐美IBD 相關(guān)，而與我國(guó)IBD 不相關(guān)，因此需要進(jìn)一步研究影響我國(guó)IBD 人群的基因位點(diǎn)。

宿主對(duì)菌群抗原刺激產(chǎn)生的異常免疫反應(yīng)被認(rèn)為是IBD 重要的發(fā)病機(jī)制［3-4］。殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein，BPI)是參與到宿主識(shí)別菌群抗原過(guò)程的重要因子，它能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合革蘭陰性(G-)菌的主要抗原脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，從而非特異性殺傷G-菌［5］，中和LPS;同時(shí)，BPI 能夠抑制LPS 與Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)等結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而減弱該復(fù)合物激活的一系列免疫炎癥反應(yīng)［6-8］，見(jiàn)圖1。因此，BPI 很可能參與到IBD 發(fā)病中。國(guó)外多項(xiàng)研究顯示BPI 為IBD 易感基因，其單核苷酸多態(tài)性Glu216Lys (即rs4358188 或c. 645 G ＞A)與新西蘭、德國(guó)、土耳其等人群的IBD 發(fā)病和臨床特征相關(guān)［9-11］，該位點(diǎn)G 替換為A 能導(dǎo)致谷氨酸變?yōu)橘?lài)氨酸，可能導(dǎo)致BPI 結(jié)合LPS 結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而可能影響B(tài)PI 清除細(xì)菌、抑制炎癥的功能;此外，國(guó)內(nèi)研究者運(yùn)用基因芯片技術(shù)從全基因組大規(guī)模篩選IBD易感基因后，發(fā)現(xiàn)BPI 基因在UC 患者外周血單核細(xì)胞中較正常人表達(dá)上調(diào)［12］。因此，BPI 很可能是中國(guó)人群的IBD 易感基因，而關(guān)于BPI Glu216Lys 與我國(guó)人群IBD 的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究將探討Glu216Lys 與我國(guó)人群IBD 易感性的關(guān)系及其對(duì)不同臨床特征的影響。

Figure 1. Bacterial antigen recognition pathway. CARD15/NOD2 could respond to the bacteria component muramyl dipeptide(MDP)［5］. LBP could bind to extracellular antigen LPS，then LBP-LPS complex is presented to the recognition receptor TLR4 expressed in membranes of epithelial cells and monocytes by CD14. Finally，CARD15/NOD2-MDP or LPS-TLR4 complex will activate the intracellular signaling pathways which lead to activation of the transcription factor，nuclear factorκB (NF-κB)，and then induce the expression of a variety of host defense genes and stimulate the innate immune response［6-8］. However，the BPI protein can effectively compete with LBP for binding to LPS and the BPI-LPS complex does not provoke subsequent immune response.圖1 細(xì)菌抗原識(shí)別通路

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

研究對(duì)象為我院2003 年～2011 年IBD 門(mén)診及住院確診的286 例IBD 患者(包括CD 173 例，UC 113 例)，以及同期332 名在我院接受健康體檢的性別、年齡匹配的健康人。IBD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2007年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)［13］，即根據(jù)臨床表現(xiàn)、小腸鋇劑造影檢查、結(jié)腸鏡檢查、雙氣囊小腸鏡/膠囊內(nèi)鏡和黏膜活檢作出臨床診斷，確診病例為經(jīng)病情觀察符合CD/UC 病程經(jīng)過(guò)或通過(guò)手術(shù)取得病理診斷者。IBD 的臨床分型采用蒙特利爾分型標(biāo)準(zhǔn)［14］。臨床資料通過(guò)查閱我科IBD 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，主要收集患者的人口學(xué)資料及臨床分型特征，包括性別、發(fā)病年齡、癥狀、吸煙史、家族史、腸外表現(xiàn)、肛周病變、臨床特征等資料。本研究已經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，標(biāo)本采集獲得研究對(duì)象的知情同意。

2 方法

2.1 基因組DNA 提取 分別采集病例及健康對(duì)照2 mL 外周血，采用天根血液基因組織DNA 提取試劑盒(北京天根有限公司提供)提取基因組DNA。具體操作步驟參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2.2 BPI Glu216Lys 基因分型 采用引物介導(dǎo)的限制性分析PCR(primer-introduced restriction analysis PCR，PIRA-PCR)方法。上游引物5’-CACTATGGGAAGACCTTACTGATTAC-3’，下 游 引 物 5’-CAGAGTCTGGAAATAAGGTTGAAGC-3’，在下游引物中引入1 個(gè)A 堿基(下劃線處)，用于構(gòu)建內(nèi)切酶Hind III 的限制性切點(diǎn)。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃30 s，51 ℃30 s，72 ℃30 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min，冷卻至4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物以限制性?xún)?nèi)切酶Hind III (New England Biolabs)于37 ℃酶切2 h，再于65 ℃20 min 使酶失活。用含溴化乙啶的4%瓊脂糖凝膠電泳。

基因型判定:PCR 產(chǎn)物為104 bp，在Hind III 內(nèi)切酶作用下，A 等位基因可被切成78 和26 bp 2 個(gè)片段(26 bp 的片段過(guò)小，難以檢測(cè));G 等位基因則不能被切開(kāi)，電泳顯示104 bp 的條帶，見(jiàn)圖2。抽樣測(cè)序結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

Figure 2. Glu216Lys mutation analysis with restriction enzyme Hind III.M:marker.圖2 Glu216Lys 位點(diǎn)Hind III 酶切電泳圖

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律，采用χ2檢驗(yàn)分析對(duì)照組樣本的群體代表性。病例組與對(duì)照組間Glu216Lys 基因型分布頻率的比較采用Pearson-χ2檢驗(yàn);基因型與IBD 臨床特征間關(guān)系采用單因素和Logistic 回歸分析，計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(odds ratio，OR)及其95%置信區(qū)間(confidence interval，CI)，其中OR 值經(jīng)性別和年齡校正。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 一般情況

病例組納入的286 名IBD 病人中，男178(62.2%)例，女108(37.8%)例，平均年齡(33.5 ±13.1)歲，見(jiàn)表1;正常對(duì)照中，男197 例(59.3%)，女135 例(40.7%)，平均年齡(32.0 ±8.2)歲;2 組間性別構(gòu)成比和年齡均無(wú)明顯差異(均P ＞0.05)。對(duì)照組Glu216Lys 基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P ＞0.05)，具有群體代表性。

表1 炎癥性腸病病人基本資料Table 1. Demographic characteristics of IBD patients

2 BPI Glu216Lys 基因型在炎癥性腸病及對(duì)照人群中頻率分布

CD 和UC 病人中，分別檢測(cè)出GG 基因型95(54.9%)和 69 (61.1%)例，GA 基 因 型 68(39.4%)和38(33.6%)例，AA 基因型10 (5.7%)和6 (5.3%)例;對(duì)照人群中，GG 基因型206(62.1%)例，GA 基因型115(34.6%)例，AA 基因型11(3.3%)例;無(wú)論是CD 還是UC 病人，Glu216Lys基因型頻率及等位基因頻率均與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P ＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 Glu216Lys 基因型在正常對(duì)照及病例中分布情況Table 2. Allelic and genotypic frequencies of the Glu216Lys polymorphism in IBD patients and controls

3 BPI Glu216Lys 基因型與IBD 臨床特征的關(guān)系

根據(jù)不同臨床特征對(duì)CD 和UC 患者進(jìn)行分層，分析Glu216Lys 基因型與疾病各類(lèi)臨床特征的相關(guān)性。單因素分析方法結(jié)果顯示該基因型與UC/CD各臨床特征不相關(guān)(P ＞0.05)，為排除混雜因素影響，進(jìn)一步采用多因素分析方法，經(jīng)年齡、性別等因素校正后，結(jié)果仍顯示該基因型與CD 或UC 的臨床特征無(wú)關(guān)(P ＞0.05)，見(jiàn)表3、4。

表3 Glu216Lys 基因型與CD 臨床特征的相關(guān)性Table 3. Association between Glu216Lys genotypes and CD clinical characteristics

表4 Glu216Lys 基因型與UC 臨床特征相關(guān)性Table 4. Association between Glu216Lys genotypes and UC clinical characteristics

討 論

BPI 是先天免疫系統(tǒng)中抵御革蘭陰性桿菌的重要因子，它對(duì)LPS 具有高親和力，能與G-菌表面LPS 及游離LPS 結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)菌體裂解、中和內(nèi)毒素以及促進(jìn)補(bǔ)體活化、增強(qiáng)調(diào)理吞噬等。BPI 在多形核細(xì)胞中表達(dá)豐富，也廣泛地表達(dá)于腸道等人體黏膜上皮細(xì)胞中［15］。國(guó)外研究報(bào)道了BPI 在IBD 患者黏膜中表達(dá)升高［16］，我國(guó)研究［13］發(fā)現(xiàn)BPI mRNA在UC 患者中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，國(guó)內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)BPI 是IBD 患者體內(nèi)抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA)的主要靶抗原之一［17］，并且BPI 自身抗體在IBD 中呈高表達(dá)，它能增強(qiáng)IBD 病人局部和全身炎癥，延長(zhǎng)炎癥持續(xù)時(shí)間［18］;故這些預(yù)示BPI 可能在IBD 中起著重要作用。BPI Glu216Lys 可以導(dǎo)致一個(gè)氨基酸改變，這可能最終影響B(tài)PI 蛋白抵御革蘭陰性菌的功能，此外，該位點(diǎn)多態(tài)性可能改變被核周型ANCA 識(shí)別的BPI 蛋白結(jié)構(gòu)，從而參與IBD 疾病過(guò)程;BPI 單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)Glu216Lys 已被證實(shí)與多國(guó)人群IBD 易感性有關(guān)［9-11］，因此，本文研究了BPI Glu216Lys 是否與中國(guó)人IBD 發(fā)病及臨床特征相關(guān)。

我們的研究結(jié)果顯示BPI Glu216Lys 與中國(guó)人群CD 或UC 的發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性，進(jìn)一步分析亦未發(fā)現(xiàn)其與疾病臨床特征相關(guān)。BPI Glu216Lys 的GG基因型頻率在德國(guó)CD 患者中相對(duì)于正常對(duì)照人群明顯下降(P ＜0.05)［10］，而在新西蘭人群中，該SNP的A 等位基因與回結(jié)腸型CD 相關(guān)(P ＜0.01，OR=1.16，95%CI:1.14 ～2.27)［9］;此外來(lái)自土耳其的研究［11］表明它與UC 和CD 發(fā)病均相關(guān)(P ＜0.01)，并且GG 基因型在激素依賴(lài)患者中表達(dá)明顯下降(P ＜0.05，OR =0.75，95%CI:0.66 ～0.86)。與這些國(guó)家人群相比，我們發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群中野生型純合子GG基因型頻率顯著增高，而突變型純合子AA 頻率顯著下降(P ＜0.05)，見(jiàn)圖3，這進(jìn)一步證實(shí)不同人群存在顯著的遺傳差異，因此我們的研究結(jié)果與這些種族人群的不同，一方面可能是我們的樣本量較小，未能發(fā)現(xiàn)兩者的聯(lián)系;另一方面，BPI 很可能與其它參與細(xì)菌識(shí)別過(guò)程的IBD 易感基因如NOD2/CARD15等相似［8］，是白種人的IBD 易感基因，而非中國(guó)人群的IBD 易感基因。

Figure 3. Frequency analysis of Glu216Lys genotypes in general population among different races. 1:Chinese population;2:Turkey population;3:Germany population;4:New Zealand population. ＊＊P ＜0.01 vs group 1.圖3 不同種族的正常人群中Glu216Lys 基因型分布頻率

綜上所述，本研究表明BPI Glu216Lys 位點(diǎn)與我國(guó)漢族人群IBD 易感性無(wú)明顯相關(guān)性，但不能排除該位點(diǎn)與其它基因位點(diǎn)的相互作用或BPI 基因的其它SNP 位點(diǎn)與我國(guó)漢族人群IBD 相關(guān)。BPI 基因與中國(guó)人群IBD 易感性關(guān)系仍需要進(jìn)一步大樣本多位點(diǎn)研究，并進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和單倍體型分析等，以進(jìn)一步明確該基因多態(tài)性在IBD 中的作用。

［1］ Farrell RJ，Peppercorn MA. Ulcerative colitis［J］. Lancet，2002，359(9303):331-340.

［2］ Shanahan F. Crohn’s disease［J］. Lancet，2002，359(9300):62-69.

［3］ Inohara N，Ogura Y，F(xiàn)ontalba A，et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2.Implications for Crohn’s disease［J］. J Biol Chem，2003，278(8):5509-5512.

［4］ Heumann D，Roger T. Initial responses to endotoxins and Gram-negative bacteria［J］. Clin Chim Acta，2002，323(1-2):59-72.

［5］ Weiss J，Elsbach P，Olsson I，et al. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes［J］. J Biol Chem，1978，253(8):2664-2672.

［6］ Gazzano-Santoro H，Parent JB，Grinna L，et al. High-affinity binding of the bactericidal/permeability-increasing protein and a recombinant amino-terminal fragment to the lipid A region of lipopolysaccharide［J］. Infect Immun，1992，60(11):4754-4761.

［7］ 耿彥婷，張軍平，徐士欣，等. PPARs 與TLR-NF-κB 信號(hào)通路［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2012，28(8):1516-1520.

［8］ Li M，Gao X，Guo CC，et al. OCTN and CARD15 gene polymorphism in Chinese patients with inflammatory bowel disease［J］. World J Gastroenterol，2008，14(31):4923-4927.

［9］ Petermann I，Huebner C，Browning BL，et al. Interactions among genes influencing bacterial recognition increase IBD risk in a population-based New Zealand cohort［J］. Hum Immunol，2009，70(6):440-446.

［10］Klein W，Tromm A，F(xiàn)olwaczny C，et al. A polymorphism of the bactericidal/permeability increasing protein (BPI)gene is associated with Crohn’s disease［J］. J Clin Gastroenterol，2005，39(4):282-283.

［11］Akin H，Tahan G，Türe F，et al，Association between bactericidal/permeability increasing protein (BPI)gene polymorphism (Lys216Glu)and inflammatory bowel disease［J］. J Crohns Colitis，2011，5(1):14-18.

［12］ 繆應(yīng)雷，李紅納，杜 艷，等. NAT1 CXCL9 BPI 和HLA-DQB1 在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)［J］. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26(22):4084-4086.

［13］中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病協(xié)作組. 中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)［J］. 中華內(nèi)科雜志，2008，47(1):73-79.

［14］Silverberg MS，Satsangi J，Ahmad T，et al. Toward an integrated clinical，molecular and serological classification of inflammatory bowel disease:report of a Working Party of the 2005 Montreal World Congress of Gastroenterology［J］. Can J Gastroenterol，2005，19 (Suppl A):5-36.

［15］ Canny G，Colgan SP. Events at the host-microbial interface of the gastrointestinal tract. I. Adaptation to a microbial world:role of epithelial bactericidal/permeability-increasing protein［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，288(4):G593-G597.

［16］Monajemi H，Meenan J，Lamping R，et al. Inflammatory bowel disease is associated with increased mucosal levels of bactericidal/permeability-increasing protein［J］. Gastroenterology，1996，110(3):733-739.

［17］Stoffel MP，Csernok E，Herzberg C，et al. Anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)directed against bactericidal/permeability increasing protein (BPI):a new seromarker for inflammatory bowel disease and associated disorders［J］. Clin Ex Immunol，1996，104(1):54-59.

［18］Schinke S，F(xiàn)ellermann K，Herlyn K，et al. Autoantibodies against the bactericidal/permeability-increasing protein from inflammatory bowel disease patients can impair the antibiotic activity of bactericidal/permeability-increasing protein［J］. Inflamm Bowel Dis，2004，10(6):763-770.