紅杉醇對(duì)2 型糖尿病大鼠肝臟炎癥損傷的保護(hù)作用*

陳祥攀， 楊解人， 郝 偉， 劉 艷， 李先偉

(皖南醫(yī)學(xué)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖241002)

隨著糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率的增加，出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥的患者逐年增多。對(duì)于糖尿病并發(fā)癥人們關(guān)注最多的是血管及神經(jīng)系統(tǒng)病變，而對(duì)于糖尿病合并肝臟損傷尤其是炎癥病變研究較少，有研究表明糖尿病患者中合并肝臟病變高達(dá)50%以上［1］。目前，臨床上均采用單一療效的降糖藥和保肝藥，且不良反應(yīng)較多。因此，研究高效、低毒、安全可靠的新型降血糖且具有保護(hù)肝臟作用的藥物具有重要意義。紅杉醇(sequoyitol，Seq)是從紅豆杉等植物提取的一種天然化合物［2］。動(dòng)物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明，Seq 能明顯競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶活性，促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖、抑制肝糖原分解和葡萄糖吸收而顯著降低DM 小鼠的血糖、降低血脂、改善自由基代謝和保護(hù)胰島β 細(xì)胞［3-4］。故本研究采用高脂高糖飼料加小劑量STZ 誘導(dǎo)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠模型，從炎癥因子角度，以腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素6(interleukin 6，IL-6)為新靶點(diǎn)，探討Seq 對(duì)DM 肝臟炎癥損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠60 只，體重(200 ±20)g，高糖高脂飼料(68.5%普通飼料、20%蔗糖、10%豬油、1%膽固醇和0.5%膽鹽)和普通飼料均購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1.2 藥品 Seq 純度70%，分子式C7H14O6，分子量194.1825(大連美侖生物技術(shù)有限公司)。STZ 粉劑(Sigma)。阿卡波糖(acarbose，Aca)每片50 mg(杭州中美華東制藥有限公司)。

1.3 試劑 血糖(blood glucose，BG)、白蛋白(albumin，ALB)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒(上海西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司)。TNF-α、IL-6 和C 反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)ELISA 檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，R﹠D 公司進(jìn)口分裝)。TRIzol RNA提取試劑盒(Invitrogen)，PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄和SYBR real-time PCR 試劑盒(TaKaRa)，三(羥甲基)氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺、N，N’-亞甲基雙丙稀酰胺、過(guò)硫酸胺和四甲基乙二胺(Amresco)，Tween-20(Sigma)，RIPA buffer 和苯甲基磺酰氟(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

2 方法

2.1 DM 肝臟炎癥損傷大鼠模型的建立 60 只大鼠經(jīng)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(7 只)與DM 肝臟炎癥損傷組(53 只)。對(duì)照組喂普通飼料，DM 肝臟炎癥損傷組給以高脂飼料。飼養(yǎng)4 周后禁食12 h，模型組1 次性腹腔注射35 mg·kg-1STZ(0 ℃以下保存，臨用前用0.1 mol·L-1pH 為4.4的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液在冰浴條件下配制成20 g·L-1的溶液)溶液，對(duì)照組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。72 h 后用血糖儀檢測(cè)空腹血糖，凡連續(xù)5 d 測(cè)得隨機(jī)空腹血糖≥11.1 mmol·L-1，ALT 和AST均高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)視為成功模型，確認(rèn)DM 肝臟炎癥損傷模型40 只，血糖和肝功能不符合要求的13 只大鼠則被剔除。

2.2 動(dòng)物分組、劑量設(shè)置及給藥方法 取造模成功的DM 肝臟炎癥損傷大鼠按預(yù)試結(jié)果設(shè)置如下組別和劑量:Seq 低劑量組(12.5 mg·kg-1·d-1，n =7)、Seq 中劑量組(25 mg·kg-1·d-1，n =7)、Seq 高劑量組(50 mg·kg-1·d-1，n =7)、Aca 陽(yáng)性對(duì)照組(20 mg·kg-1·d-1，n=7)和模型組(雙蒸水5.0 mg·kg-1·d-1，n =12)，另設(shè)正常對(duì)照組(雙蒸水5.0 mg·kg-1·d-1，n =7)，按上述設(shè)定劑量，藥物用雙蒸水充分溶解后現(xiàn)配現(xiàn)用，于每天18:00 ～19:00 灌胃，持續(xù)6 周。其中模型組有5 只因高糖、肝功能損傷嚴(yán)重而死亡。

2.3 標(biāo)本采集和制備 于末次給藥后，大鼠稱重，麻醉(戊巴比妥鈉30 mg·kg-1，ip.)，腹主動(dòng)脈采血后，取肝臟于4 ℃0.9% NaCl 沖洗，濾紙拭干，稱濕重計(jì)算肝臟指數(shù)［5］:肝臟指數(shù)=肝臟重量(g)/體重(g)。

2.4 病理組織學(xué)檢查 取相同部位肝臟，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)變化。

2.5 血糖和肝功能測(cè)定 取5 mL 血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min 制備血清，采Dimension RxL Max全自動(dòng)生化分析儀(西門(mén)子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品上海有限公司)測(cè)定BG、ALB、ALT 和AST。

2.6 CRP、TNF-α 和IL-6 含量測(cè)定 取30%相同部位肝臟，充分研磨后以3 000 r/min 離心10 min，留取上清液，制備10%組織勻漿，用DNM-9602 酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，ELISA 法測(cè)定肝組織勻漿CRP、TNF-α 和IL-6 含量。

2.7 熒光定量實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)TNF-α mRNA 表達(dá)

采用TRIzol 提取肝臟RNA 后，PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件:37 ℃15 min，85 ℃5 s，反應(yīng)體系:總RNA 5 μL，5 ×PrimeScript Buffer 2 μL，Random 6 mers 0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，RNase-free dH2O 1.5 μL。所得cDNA 在熒光定量實(shí)時(shí)PCR 儀(7300 Real-Time PCR System，ABI)上進(jìn)行反應(yīng)，使用Power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒，以2 μL cDNA為模板，以β-actino 為內(nèi)參照，PCR 擴(kuò)增基因片斷(引物序列見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件:95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃31 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系:SYBR? Premix Ex TaqTM(2 ×)5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0.2 μL，RNase-free dH2O 2.4 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)結(jié)束后，運(yùn)行熔解曲線程序，分析產(chǎn)物特異性。用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)各組ΔΔCt 值，計(jì)算相應(yīng)RQ 值，比較各組mRNA 的表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用DAS 2.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析有LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠空腹BG 和肝臟指數(shù)的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠空腹BG 和肝臟指數(shù)明顯升高(P ＜0.01);與模型組相比，Seq 高、中劑量組大鼠空腹BG 和肝臟指數(shù)顯著降低(P ＜0.01)，見(jiàn)圖1。以上結(jié)果說(shuō)明Seq 能明顯降低DM肝臟炎癥損傷大鼠BG 和肝臟指數(shù)。

Figure 1. Effects of sequoyitol on fasting blood glucose (BG;A)and liver index (B)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions.Mean±SD.n=7. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.圖1 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠空腹BG 和肝臟指數(shù)的影響

2 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝臟病理改變的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝竇狹窄，結(jié)構(gòu)不清，匯管區(qū)有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);小葉中央?yún)^(qū)及周邊區(qū)大部分肝細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不等的以大泡性脂肪滴為主的脂滴空泡，核居邊，細(xì)胞界限不清;并可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀或灶狀壞死。與模型組相比，Seq組上述病理變化隨劑量增加逐漸改善，尤其高劑量組改善較為明顯，見(jiàn)圖2。這說(shuō)明Seq 具有減輕DM肝臟炎癥損傷大鼠肝臟脂質(zhì)堆積及炎性變的作用。

3 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝功能的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清ALT 和AST 活性明顯增高而ALB 含量明顯降低(P ＜0.01);與模型組相比，Seq 各劑量組大鼠血清ALT和AST活性不同程度降低，而ALB含量升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見(jiàn)圖3。這說(shuō)明Seq 具有改善高糖高脂誘導(dǎo)DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝功能的作用。

Figure 2. HE staining of rat hepatic tissues in each group(×200).A:control group;B:model group;C:Seq 12. 5 mg·kg -1 group;D:Seq 25 mg·kg -1 group;E:Seq 50 mg·kg -1 group;F:Aca group.圖2 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝臟病理改變的影響

Figure 3. Effects of sequoyitol on serum levels of ALT (A)，AST(B)and ALB (C)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.圖3 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝功能的影響

4 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝臟CRP 的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝臟CRP 含量顯著升高(P ＜0.01);與模型組相比，Seq 各組大鼠CRP 含量明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見(jiàn)圖4，這說(shuō)明Seq 具有降低2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝臟CRP 的作用。

5 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝組織TNFα 和IL-6 的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織TNF-α和IL-6 含量明顯升高(P ＜0.05 或P ＜0.01);與模型組相比，Seq 各劑量組大鼠肝組織TNF-α 和IL-6含量明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，尤以高劑量組明顯(P ＜0.01)，見(jiàn)圖5。以上結(jié)果說(shuō)明Seq 具有減輕DM 肝臟炎癥損傷大鼠炎癥的作用。

Figure 4. Effect of sequoyitol on hepatic CRP in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean ± SD. n =7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs model.圖4 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝臟CRP 的影響

Figure 5. Effects of sequoyitol on hepatic TNF-α (A)and IL-6 (B)in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs model.圖5 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝組織TNF-α 和IL-6 的影響

6 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝組織TNFα mRNA 表達(dá)的影響

經(jīng)real-time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯升高(P ＜0.01);與模型組相比，Seq 各組均能抑制TNF-α mRNA 表達(dá)上調(diào)(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見(jiàn)圖6。

Figure 6. Effects of sequoyitol on hepatic TNF-α mRNA in type 2 diabetic rats with liver inflammatory lesions. Mean±SD.n=7. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05，##P＜0.01 vs model.圖6 Seq 對(duì)2 型DM 肝臟炎癥損傷大鼠肝組織TNF-α mRNA 表達(dá)的影響

討 論

肝臟是物質(zhì)代謝的重要器官，也是常見(jiàn)的DM慢性損傷的靶器官之一［6］。DM 肝臟損傷包括形態(tài)和功能改變，其特征性病理表現(xiàn)為糖原沉積、脂肪變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、Mallary 小體形成及肝纖維化［7-9］。本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料喂養(yǎng)10 周，第4 周腹腔注射35 mg·kg-1STZ 溶液制備2 型糖尿病大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠血糖明顯升高，肝功能?chē)?yán)重受損，組織病理學(xué)檢測(cè)顯示出明顯的肝細(xì)胞水腫、點(diǎn)狀或灶狀壞死，肝小葉中肝竇狹窄，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明STZ+高糖高脂誘導(dǎo)的DM 肝臟炎癥損傷模型已成功復(fù)制，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致［10-11］。

研究顯示紅杉醇具有明顯的降糖作用［2-4］，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著紅杉醇的劑量增加，DM 肝病大鼠的血糖逐漸下降，肝臟指數(shù)減小;肝細(xì)胞水腫、點(diǎn)狀或灶狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等均有不同程度的改善。生化指標(biāo)檢測(cè)進(jìn)一步證明紅杉醇能明顯改善糖尿病肝損傷的肝功能，升高血清白蛋白含量。這些結(jié)果表明，紅杉醇不僅能夠降低DM 大鼠的血糖，同時(shí)具有保肝、改善DM 肝臟炎癥損傷的作用。

文獻(xiàn)報(bào)道，在糖尿病肝損傷中活性氧簇可誘導(dǎo)肝組織釋放TNF-α、IL-6 等，TNF-α 通過(guò)干擾線粒體呼吸鏈并形成超氧陰離子而增加線粒體膜的通透性，加劇線粒體損傷［12-13］;IL-6 等激活Kupffer 細(xì)胞，活化的Kupffer 細(xì)胞可以繼續(xù)分泌細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重肝損傷并誘導(dǎo)肝纖維化［10，14］，羅布麻寧可通過(guò)降低DM 小鼠心肌TNF-α 表達(dá)提高心臟功能［15］。本研究顯示，炎癥因子TNF-α、IL-6 在模型組大鼠肝組織含量明顯升高，經(jīng)real-time PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組TNF-α mRNA 的表達(dá)水平也顯著升高，肝功能受損明顯，提示炎癥因子可能是引起肝功能受損的原因之一。而經(jīng)紅杉醇治療后肝組織TNFα mRNA、TNF-α 及IL-6 水平明顯降低，提示紅杉醇可以通過(guò)降低大鼠肝臟TNF-α 和IL-6 表達(dá)而改善肝臟功能。但紅杉醇是通過(guò)何種機(jī)制調(diào)節(jié)TNF-α 和IL-6 的表達(dá)，有待進(jìn)一步研究。

［1］ Shakil A，Church RJ，Rao SS. Gastrointestinal complications of diabetes［J］. Am Fam Physician，2008，77(12):1697-1702.

［2］ 王音音，李桂峰，王 霆. 紅杉醇在植物種類(lèi)中的分布［J］.今日藥學(xué)，2008，18(1):70-74.

［3］ 孫明杰，王 霆. 用于糖尿病預(yù)防和治療的紅杉醇和紅杉醇植物提取物:中國(guó)，CN1706369［P］.2004.

［4］ 梁敬鈺，吳斐華，鮑官虎，等. 一種防治糖尿病的植物提取物及其制備方法與藥物用途:中國(guó)，CN1488344A［P］.2004.

［5］ 韓 冰，謝汝佳，洪 琴，等. miR-200s 在中藥丹芍化纖干預(yù)大鼠肝纖維化過(guò)程中的表達(dá)變化［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2012，28(11):1950-1954.

［6］ Harrison SA. Liver disease in patients with diabetes mellitus［J］. J Clin Gastroenterol，2006，40(1):68-76.

［7］ Younossi ZM，Gramlich T，Liu YC，et al. Nonalcoholic fatty liver disease:assessment of variability in pathologic interpretations［J］. Mod Pathol，1998，11(6):560-565.

［8］ Gawrieh S，Knoedler DM，Saeian K，et al. Effects of interventions on intra-and inter observer agreement on interpretation of nonalcoholic fatty liver disease histology［J］.Ann Diagn Pathol，2011，15(1):19-24.

［9］ Hossain N，Afendy A，Stepanova M，et al. Independent predictors of fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease［J］. Clin Gastroenterol Hepatol，2009，7(11):1224-1229.

［10］ Czaja MJ，Liu H，Wang Y. Oxidant-induced hepatocyte injury from menadione is regulated by ERK and AP-1 signaling［J］. Hepatology，2003，37(6):1405-1413.

［11］ Poli G. Pathogenesis of liver fibrosis:role of oxidative stress［J］. Mol Aspects Med，2000，21(3):49-98.

［12］ Czaja MJ. Cell signaling in oxidative stress-induced liver injury［J］. Semin Liver Dis，2007，27(4):378-389.

［13］Mirza S，Hossain M，Mathews C，et al. Type 2-diabetes is associated with elevated levels of TNF-α，IL-6 and adiponectin and low levels of leptin in a population of Mexican Americans:a cross-sectional study［J］. Cytokine，2012，57(1):136-142.

［14］Jiao K，Liu H，Chen J，et al. Roles of plasma interleukin-6 and tumor necrosis factor-α and FFA and TG in the development of insulin resistance induced by high-fat diet［J］. Cytokine，2008，42(2):161-169.

［15］申 鍔，陳瑞珍，楊英珍，等. Apocynin 降低1 型糖尿病小鼠心肌組織炎癥因子的表達(dá)［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2009，25(11):2109-2112.