加壓提取與加熱回流提取三七皂苷物抗氧化活性比較研究

吳麗霞 梁翠霞 廖樂樂 吳鐵松

1.廣東省深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518110；2.廣東省深圳流花醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518002

三七（Panax Notoginseng）為五加科人參屬草本植物，是我國珍貴的特產中藥，有著悠久的用藥歷史。皂苷是三七最主要的生物活性成分，具有散瘀止血、消腫定痛等功效[1－2]。目前，提取三七中皂苷成分的方法有水煎煮法、醇回流法、大孔吸附樹脂法、微波提取法、超聲提取法、超臨界萃取等[3]。上述方法技術較為成熟，但存在或提取率低，或提取物生物活性差，或處于實驗研究階段難以大規(guī)?；纳a等缺點。因此，新技術的開發(fā)是我國中藥產業(yè)發(fā)展的戰(zhàn)略需求，同時也是中藥現代化道路上不斷探索的熱點課題。

加壓提取技術[4]是近年來發(fā)展起來的一項新興提取技術，其原理是在密閉容器內，通過升高壓力使提取溶劑在超過沸點的溫度下仍保持液體狀態(tài)。在中藥提取過程中，通過施加一定的壓力，使藥材內部的細胞壁被破壞從而加速溶劑的擴散；同時，升高壓力還能使溶劑在高于沸點情況下仍保持液體狀態(tài)，改善溶劑的溶解性和選擇性，從而提高浸出速度和浸出率，縮短提取時間，減少溶劑損耗[5]。

本文擬采用加壓提取技術，從三七中提取皂苷成分，通過對提取壓力、溫度、時間、料液比、乙醇濃度、藥材粒徑等工藝參數的研究，運用均勻設計優(yōu)化軟件，得出最優(yōu)回歸方程及最佳提取工藝參數，并與加熱回流提取法進行比較，探討加壓提取技術對三七皂苷物氧化活性及抑菌活性的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

采用美國Waters公司Waters2695/2996型高效液相色譜儀，瑞士Foss Tecator公司生產的1095knifetec樣品研磨機，美國Dionex公司生產的ASE200型溶劑加速提取儀，上海亞榮生化儀器廠RE－52型旋轉蒸發(fā)儀，上海博迅實業(yè)有限公司生產的GZX－9070MBE型干燥箱、Spx－250B－Z生化培養(yǎng)箱，上海分析儀器廠生產的UV757CRT紫外可見分光光度計。

1.2 試藥

三七總皂苷標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號：870－200001）；人參皂苷Rb1（中國藥品生物制品檢定所，批號：110704－200216）；人參皂苷 Rg1（中國藥品生物制品檢定所，批號：0703－2000221）；乙醇、甲醇、乙腈均為色譜純，乙醚、香草醛為分析純；DPPH（美國sigma公司）；三七藥材購自云南文山；大腸桿菌、枯草桿菌、四聯球菌、金黃色葡萄球菌來自廣東省深圳市龍華新區(qū)觀瀾人民醫(yī)院藥劑實驗室。

2 方法

2.1 加壓提取與加熱回流提取

加壓溶劑提取取三七藥材粉碎成粗粉，準確稱定40 g，置加壓提取裝置，取400 mL蒸餾水，在溫度110℃、壓力0.3 MPa下加壓浸提30 min，濃縮藥液到135 mL，醇沉濃度到60%，靜置取上清液揮干；加熱回流提取同樣取三七藥材粗粉40 g，加蒸餾水回流提取3次，劑量200 mL，合并濾液濃縮醇沉到60%，靜置取上清液揮干。

2.2 樣品溶液的制備

準確量取三七粉3.0 g，加壓溶劑提取，取提取液11 mL到25 mL容量瓶中，定容取液1 mL于試管中，正丁醇萃取3次，合并萃取液，水浴揮干，加0.2 mL香草醛－冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，60℃加熱15 min，冰水浴冷卻后加5 mL冰醋酸，用光度計測定吸收度，以甲醇作空白對照，在最大吸收波長547 nm處測定吸光值，得到回歸方程：Y=4.2008X－0.0009，相關系數 r=0.9992。

2.3 標準溶液制備

準確稱取13 mg三七總皂標準品，置于25 mL容量瓶中，采用甲醇溶解。取1.0 mL置于試管中，同樣加入香草酸冰醋酸及高氯酸，在400～900 nm用紫外分光光度計掃描。

總皂苷提取收率（%）=0.0198（V/V1）（l/m）×100%

V表示提取液總體積（mL）；V1表示檢測時所提取體積（mL）；m 表示三 t質量（g）。

2.4 抗氧化活性測定

取提取物用甲醇稀釋搖勻待測，分別配置成2.5 mL 1，1－苯基－2=三硝基苯肼（DPPH）溶液+1.5 mL 甲醇、2.5 mL DPPH溶液+1.5 mL待測樣品甲醇溶液、2.5 mL甲醇溶液+1.5 mL待測櫚甲醇溶液，室溫靜置30 min，在514 nm波長處測定吸光度，均取3次平均值。

清除率：Y=（1－ ）×100%

A0表示未加樣品溶液DPPH溶液吸光度；Ai表示加入樣品溶液后DPPH溶液吸光度；Aj表示表示DPPH溶液與樣品溶液混合后的吸光度。

2.5 體外抑菌實驗

參照周德慶《微生物學實驗》[6]制備菌懸液和培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上等距離找孔，加入藥液，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測定抑菌圈直徑大小，進行抑菌效果比較。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數據進行分析，計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 三七皂苷單因素參數

設計不同壓力、溫度、料液比、乙醇濃度、藥材粒徑等參數數據，見表1。

表1 三七皂苷提取率單因素參數水平

3.2 壓力對三七皂苷提取率的影響

在溫度120℃、料液比1∶20、時間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑 80 目的參數條件下，選取 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 MPa不同壓力，考查壓力對三七皂苷提取率的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，隨著壓力的升高，三七皂苷提取率的提取也逐步增加，當壓力增加到0.8 MPa時，提取率為最高值8.62%，從0.8～1.0 MPa，提取率略有下降，故適宜壓力條件應為0.8 MPa。

3.3 溫度對三七皂苷提取率的影響

在維持壓力 0.8 MPa、料液比 1∶20、時間 15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目的條件下，設定溫度為100、110、120、130、140、150℃，考查溫度對三七皂苷提取率的影響，結果見圖2。

從圖2可以看出，隨著溫度的升高，三七總皂苷的提取率也逐漸增加，當溫度達到140℃時，提取率達到一個最大值，從140℃到達150℃時，提取率基本維持恒定，因此適宜溫度條件應為140℃。

同理在設定壓力、溫度等一定值的條件下，考查料液比、時間、乙醇濃度、藥料粒徑對三七總皂苷提取率的影響，可以看出適宜的工藝條件分別為：液比1∶20、時間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。

3.4 均勻設計優(yōu)化結果

根據本文對加壓撮與加熱回流提取法的比較，本文在假定料液比、乙醇濃度、藥料粒徑恒定的情況下，考查壓力、濕度、時間對三七總皂苷提取率的影響，采用均勻設計方法設計實驗方案見表2。

表2 均勻設計優(yōu)化實驗結果

根據均勻設計軟件數據分析功能可以得到三七皂苷有關提取率與壓力、溫度、時間的回歸方程。以Y代表三七皂苷總提取率，X1表示提取壓力，X2表示提取溫度，X3表示提取時間，回歸方程如下：

Y=3.284 780 5+0.007 742X1+0.062 748 2X2+0.035 245 7X3－0.000 003 8－0.000 078 6X1X3－0.000 856 4+0.000 235 4X2X3

同時，根據均勻設計軟件分析，可以得到三七總皂苷的最佳提取工藝參數是：壓力0.8 MPa、溫度120℃、料液比1∶20、時間15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。提取得率的預測區(qū)間為3.74%～8.55%。

3.5 最佳提取工藝參數的驗證結果

根據均勻設計軟件得出的最佳提取工藝參數連續(xù)進行3次驗證試驗，三七總皂苷提取率分別為71.35%、73.68%、72.41%，平均提取率為72.48%，試驗結果與預測結果非常接近，重復性也很好，表明優(yōu)化結果具有可靠性。

3.6 加壓提取與加熱回流提取比較

加壓提取法提取時間顯著低于加熱回流法（P＜0.01），三七總皂苷加壓提取率明顯高于加熱回流提取率（P＜0.05），兩種方法清除率、抑菌活性比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 加壓提取與加熱回流提取相關指標比較（±s）

表3 加壓提取與加熱回流提取相關指標比較（±s）

方法 時間（min）加壓提取加熱回流提取t/χ2值P值15.12±3.14 312.25±85.41 12.654＜0.01提取率（%）清除率（%）抑菌圈直徑（mm）大腸桿菌 金黃色葡萄球菌 枯草桿菌 四聯球菌73.14±8.65 52.32±6.54 6.241＜0.05 91.82±9.86 91.20±10.21 0.732＞0.05 16.56±3.14 18.12±4.21 0.921＞0.05 15.02±4.25 16.15±5.23 0.873＞0.05 16.25±3.47 17.21±4.26 0.824＞0.05 15.26±3.62 17.12±35.24 0.856＞0.05

4 討論

三七主要活性成分為皂苷類，根據《中國藥典》2000年版規(guī)定，三七藥材人參皂苷（Rg1+Rb1）不少于3.8%，總皂苷和人參皂苷評價提取三七皂苷類成分提取效果的指標[7，8]。溫度、壓力、提取時間是影響提取效率的主要因素[9]。在一定的范圍內，溫度升高會提高溶劑的溶解性能，加快分子擴散速度，影響表面平衡，從而加速提取過程中的質量轉移[10]加壓溶劑提取能夠提供吸附過程中的活化能，降低待測物和基質物的交互作用，同時降低溶劑的黏度和表面張力，提高滲透性能，同時必須注意的是溫度與壓力控制的相關性[11]，壓力控制就是為了保持溶劑處于液體狀態(tài)，從而保證提取的順利進行[12]。

植物活性成分非常復雜，不同物質提取工藝不同[13]。趙文英等[14]通過加壓提取法與乙醇回流提取法的比較研究，證實在相同藥材粒徑和料液比的情況下，加壓提取法設定壓力500 kPa、溫度130℃、乙醇體積分數40%、粒徑600目時，加壓提取法具有省時和高效的優(yōu)點。本文研究表明，根據均勻設計軟件分析，三七總皂苷的最佳提取工藝參數是：壓力 0.8 MPa、溫度 120℃、料液比 1∶20、時間 15 min、乙醇濃度80%、藥料粒徑80目。提取得率的預測區(qū)間為：3.74%～8.55%。通過對加壓提取和加熱回流提取的比較研究可以發(fā)現，加壓提取法三七總皂苷提取率[（73.14±8.65）%]明顯高于加熱回流提取[（52.32±6.54）%]（P ＜ 0.05），提取時間[（15.12±3.14）min]顯著低于加熱回流法[（312.25±85.41）min]（P＜0.01），兩種方法清除率、抑菌活性比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。楊薇薇等[15]通過對三葉草總異黃酮采用加壓提取技術與加熱回流提取法的對比研究，在優(yōu)化提取工藝參數后，加壓提取紅三葉草總異黃酮得率和質量分數為57.0 mg/g和8.85%，明顯高于加熱回流法。

綜上所述，加壓提取技術通過對工藝參數的優(yōu)化，能夠提高三七皂苷物有效成分的提取率，縮短提取時間，不影響皂苷類成分抗氧化活性和抑菌活性，而且重復性好，操作模式多樣化，操作過程自動化，適宜于三七皂苷的工業(yè)化生產。

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