林蛙皮中透明質(zhì)酸含量分析

姜大成,修偉晶,劉 丹

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春 130117）

林蛙皮是指中國(guó)林蛙軀干表面的皮膚,作為生產(chǎn)哈蟆油的副產(chǎn)品,每年剝完哈蟆油后剩下的林蛙皮可多達(dá)數(shù)百?lài)?且目前林蛙皮多被棄掉或作飼料用,其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值沒(méi)有得到充分利用。林蛙可以利用皮膚呼吸并吸收水分,其機(jī)體具有完善的保濕系統(tǒng),因此具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。筆者采用紫外可見(jiàn)分光光度法,分析林蛙皮中透明質(zhì)酸的含量。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 購(gòu)買(mǎi)自蛙場(chǎng)的中國(guó)林蛙,經(jīng)鑒定為蛙科動(dòng)物中國(guó)林蛙（rana temporaria chensinensis）。懸掛風(fēng)干,風(fēng)干后剝?nèi)≤|干表面一層薄皮,粉碎為0.5 cm2的粗粉。真空袋內(nèi)保存,用前低溫烘干。

1.2 儀器與試劑 TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、D-葡萄糖醛酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所）、乙酰丙酮（天津精細(xì)化工研究所）、對(duì)-二甲氨基苯甲醛（天津精細(xì)化工研究所）、濃硫酸（北京化工廠）、咔唑（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HA粗品的提取[3]林蛙皮粗粉50 g,加入適量的蒸餾水,以完全浸沒(méi)為準(zhǔn),4℃保存過(guò)夜,取出,研磨,回收提取液,得提取液140 mL,以 10∶1比例加入醋酸鈉,攪拌使醋酸鈉全溶,加入等體積氯仿:正丁醇（4∶1）溶液。吸取上層水相,量得為120 mL,加入2倍體積的無(wú)水乙醇240 mL,過(guò)夜,使之沉淀。收集沉淀,低溫烘干得HA粗品,0.756 8 g。

2.2 N-乙酰氨基葡糖含量測(cè)定

2.2.1 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取HA樣品50 mg,加6 mol/L鹽酸5 mL溶解,在沸水浴中水解2 h,取出放置室溫,稀氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.0,加水定容至25 mL,精密量取水解液1 mL,加入乙酰丙酮試液1 mL,置沸水中水浴15 min,取出冰水冷卻至室溫,再加入對(duì)-二甲氨基苯甲醛試液1 mL,加無(wú)醛乙醇至10 mL,放置30 min,待測(cè)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,置帶塞試管中,分別加水至2 mL,配制成濃度為 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的溶液,分別加入乙酰丙酮試液 1 mL,置沸水中水浴15 min,取出冰水冷卻至室溫,再加入對(duì)-二甲氨基苯甲醛試液1 mL,加無(wú)醛乙醇至10 mL,室溫放置30 min,以空白管為空白,在531 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（見(jiàn)表1）,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得回歸方程為Y=4.805X+0.156 5（R=0.999,n=5）,表明本品在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 樣品測(cè)定 精密量取樣品溶液0.4 mL,加水至1 mL,按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備、顯色、測(cè)定吸收度,見(jiàn)表1。

表1 樣品中N-乙酰氨基葡糖測(cè)定

2.3 D-葡萄糖醛酸含量測(cè)定

2.3.1 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取HA粗品50mg,蒸餾水溶解,定容至25 mL,取1 mL,在冰浴的條件下緩慢加入5 mL硼砂硫酸試液,在沸水浴中加熱10 min,取出后冷卻至室溫,加0.2 mL咔唑試液,沸水浴中加熱15 min,冷卻至室溫,待測(cè)[4]。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備 精密吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液于試管中,加水至1mL,配制成濃度為 0.022、0.044、0.066、0.088、0.11 mg/mL 的溶液,在冰浴的條件下緩慢加入5 mL硼砂硫酸試液,沸水浴中加熱10min,取出,冷卻至室溫,加0.2 mL咔唑試液,沸水浴中加熱15 min,冷卻至室溫,以空白管為空白對(duì)照,在532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度,以D-葡萄糖醛酸鈉濃度對(duì)吸光度作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得回歸方程為Y=6.591X+0.135（R=0.999 5,n=5）?？梢?jiàn)本品在質(zhì)量濃度0.022～0.11 mg/mL內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3.3 樣品測(cè)定 精密量取樣品溶液0.4 mL,加水至1 mL,按4.2項(xiàng)下制備、顯色、測(cè)定吸收度,見(jiàn)表2。

表2 樣品中D-葡萄糖醛酸含量測(cè)定

3 結(jié)果與討論

林蛙皮50 g,提取得透明質(zhì)酸粗品0.736 5 g,得率1.47%,透明質(zhì)酸粗品中N-乙酰氨基葡糖含量33.143mg/g,蛙皮中N-乙酰氨基葡糖含量0.488 2 mg/g,透明質(zhì)酸粗品D-葡萄糖醛酸含量為26.036 mg/g,林蛙皮中D-葡萄糖醛酸含量為0.383 5 mg/g。N-乙酰氨基葡糖含量與D-葡萄糖醛酸含量接近1∶1。

透明質(zhì)酸的定量分析法有化學(xué)分析、色素結(jié)合、酶分析、電泳分析、高效液相法等,較為經(jīng)濟(jì)的是化學(xué)分析法,筆者采用比色法,利用透明質(zhì)酸中D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺接近1∶1原理[5],采用Elson-Morgan法及咔唑法,分別測(cè)定N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸的量。Elson-Morgan法原理為,氨基葡萄糖結(jié)構(gòu)中具N-甲基葡萄糖胺,在堿性溶液中與乙酰丙酮反應(yīng)生成帶有吡咯環(huán)的N-乙酰衍生物,再與對(duì)N-二甲氨基苯甲醛在酸性醇溶液中形成紅色縮合物,該縮合物于530 nm有最大吸收;咔唑法利用分子結(jié)構(gòu)中所含的己糖醛酸,在濃硫酸介質(zhì)條件下與咔唑試劑反應(yīng),生成的紅色物質(zhì)在530 nm有最大吸收。本組采用Elson-Morgan法和咔唑法分別測(cè)定透明質(zhì)酸中N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸的量,化學(xué)分析法較其他方法經(jīng)濟(jì)適用,且特異性和準(zhǔn)確性高。

[1]郭學(xué)平,賀艷麗,孫茂利.透明質(zhì)酸在保健食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)生化藥物雜志,2000,23（l）:50-51.

[2]凌沛學(xué),賀艷麗.透明質(zhì)酸的臨床研究應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)生化藥物雜志,1998,19（4）:200.

[3]李潤(rùn),倪杭生.羊眼透明質(zhì)酸制備工藝的改進(jìn)[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志,1999,30（7）:289.

[4]常育,姚宏,蘭英.透明質(zhì)酸的制備方法[J].延安大學(xué)學(xué)報(bào),2009,7（3）:129-130.

[5]董偉,范旭,曹光群.分光光度法測(cè)定化妝水中透明質(zhì)酸含量[J].應(yīng)用化工,2010,39（2）:293-294.