淡竹葉品質(zhì)與主導(dǎo)氣候因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析△

邵瑩，吳啟南，樂巍，周婧

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

淡竹葉品質(zhì)與主導(dǎo)氣候因子的灰色關(guān)聯(lián)度分析△

邵瑩，吳啟南*，樂巍，周婧

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023)

氣候因子對(duì)植物的生長(zhǎng)及其有效成分含量有重要影響，為尋找淡竹葉優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)，有效保護(hù)和開發(fā)利用淡竹葉資源，本文采用高效液相色譜法，研究了14個(gè)淡竹葉產(chǎn)地中7種有效成分的含量差異，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析，探討其與氣候因子的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明：降水量為有機(jī)酚酸類成分的氣候主導(dǎo)因子，7月份均溫和年平均氣溫為影響淡竹葉中黃酮類成分含量的氣候主導(dǎo)因子。7月份均溫、年平均氣溫和降水量可作為尋找和開發(fā)淡竹葉道地產(chǎn)區(qū)的參考指標(biāo)。本研究為科學(xué)合理保護(hù)和開發(fā)淡竹葉資源，開展淡竹葉GAP種植研究，保證中成藥生產(chǎn)原料質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)和參考。

淡竹葉；有效成分；氣候因子；灰色關(guān)聯(lián)度

在自然條件下，植物的生長(zhǎng)發(fā)育、器官形成及次生代謝產(chǎn)物的累積與環(huán)境因子關(guān)系密切。生長(zhǎng)環(huán)境是引起植物次生產(chǎn)物含量差異的一個(gè)重要方面，溫度、光照、水分等氣候因子作為主要的環(huán)境因子[1-2]，通過單一或相互作用影響著藥用植物的品質(zhì)[3-4]。在不同的氣候條件下，藥材的性狀和質(zhì)量有一定的差異，氣候因子在年內(nèi)分布的不均勻性對(duì)植物次生代謝具有重要影響[5-6]。

灰色關(guān)聯(lián)度分析(Gray Relational Analysis)依據(jù)各因素?cái)?shù)列曲線形狀的接近程度做發(fā)展態(tài)勢(shì)的分析，基于灰色系統(tǒng)的灰色過程，進(jìn)行因素間時(shí)間序列的比較，以確定主導(dǎo)因素，是一種動(dòng)態(tài)過程的研究。其意義在于在系統(tǒng)發(fā)展過程中，如果兩個(gè)因素變化的態(tài)勢(shì)是一致的，即同步變化程度較高，則可以認(rèn)為兩者關(guān)聯(lián)較大；反之，則兩者關(guān)聯(lián)度較小。因此，灰色關(guān)聯(lián)度分析對(duì)于一個(gè)系統(tǒng)發(fā)展變化態(tài)勢(shì)提供了量化的度量，基于其以上特性，本實(shí)驗(yàn)中將其運(yùn)用于中藥材品質(zhì)與主導(dǎo)氣候因子之間的關(guān)聯(lián)分析。

淡竹葉(Herba Lophatheri)為禾本科(Gramineae)植物淡竹葉(LophatherumgracileBrongn.)的干燥莖葉，具有清熱瀉火，除煩止渴，利尿通淋等功效。目前市場(chǎng)上的商品淡竹葉均系野生，其主要產(chǎn)區(qū)隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展而逐年減少退化，因此，亟需尋找其新的優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)。本實(shí)驗(yàn)研究了各產(chǎn)地淡竹葉有效成分含量差異，運(yùn)用灰色關(guān)聯(lián)度分析，分析其與氣候因子之間的關(guān)聯(lián)度，明確影響淡竹葉生長(zhǎng)及有效成分累積的主導(dǎo)氣候因子，多方面探索淡竹葉次生代謝產(chǎn)物含量和生態(tài)因素的關(guān)系，其研究結(jié)果對(duì)高品質(zhì)淡竹葉產(chǎn)區(qū)選擇有重要意義，并為應(yīng)用現(xiàn)代生態(tài)學(xué)理論，科學(xué)合理選擇中藥材規(guī)范化生產(chǎn)區(qū)域，保證中成藥生產(chǎn)原料質(zhì)量以及中藥材按需生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域自然概況及氣候因子

經(jīng)資源調(diào)查結(jié)果顯示，淡竹葉主要分布于華東、西南北亞熱帶、中亞熱帶，涉及江蘇、浙江、安徽、福建、江西、湖北、湖南、廣東、廣西、四川各省。

淡竹葉主要產(chǎn)區(qū)采樣地的經(jīng)緯度及海拔見表1。各采樣地經(jīng)緯度略有差異，海拔高度不等，各樣地間立地環(huán)境差異顯著。海拔高度、年平均氣溫、1月份平均氣溫、7月份平均氣溫、年降水量、年日照時(shí)數(shù)和無霜期7個(gè)氣候因子都有很大差異。各氣候因子數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計(jì)各樣地氣象記錄及鄰近的氣象觀測(cè)站2009-2011年觀測(cè)記錄平均值獲得。

表1 各樣地經(jīng)緯度及海拔高度

1.2 淡竹葉化學(xué)成分含量測(cè)定[7]

1.2.1 儀器與試藥

Waters 2695-2996高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)。

對(duì)照品反式對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、異牡荊苷對(duì)照品(上海融合醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司)，日當(dāng)藥黃素對(duì)照品(南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)，牡荊苷、木犀草苷對(duì)照品(上海永恒生物科技有限公司)。

試劑：乙腈、甲醇(色譜純)、乙酸(分析純)、超純水。

14批淡竹葉藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室吳啟南教授鑒定為禾本科植物淡竹葉LophatherumgracileBrongn.的莖葉。

1.2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

Elite Sino Chrom BP C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-1%冰醋酸為流動(dòng)相，梯度洗脫；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為331 nm；柱溫25 ℃。反式對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、日當(dāng)藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷色譜峰與相鄰色譜峰分離度大于2.0，理論塔板數(shù)均大于70 000。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取反式對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、日當(dāng)藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷、木犀草苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成含混合溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.4 供試品溶液的制備

稱取淡竹葉藥材粗粉約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液30 mL，靜置1 h，超聲處理2次，每次30 min，濾過。合并濾液，水浴揮干。加70%甲醇溶液溶解，置5 mL量瓶中，加溶液至刻度。搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

1.2.5 線性關(guān)系考察

精密依次吸取混合對(duì)照品溶液0.1，1，2，5，10，20 μL進(jìn)樣。以對(duì)照品質(zhì)量X(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍。反式對(duì)香豆酸：Y=3.377 1×106X-4.222 4×102，r=0.999 9，(0.020 2～4.040 0 mg·mL-1)；異葒草苷：Y=3.677 2×106X-2.644 5×104，r=0.999 9，(0.020 4～4.080 0 mg·mL-1)；葒草苷：Y=2.247 6×106X-2.542 9×104，r=0.999 9，(0.019 7～3.940 0 mg·mL-1)；日當(dāng)藥黃素：Y=2.302 9×106X-3.091 8×104，r=0.999 9，(0.020 0～4.000 0mg·mL-1)；牡荊苷：Y=3.287 2×106X-7.770 4×103，r=0.999 9，(0.019 8～3.960 0 mg·mL-1)；異牡荊苷：Y=2.756 9×106X-8.581 1×103，r=0.999 9，(0.020 0～4.000 0 mg·mL-1)；木犀草苷：Y=2.821 2×106X-1.014 9×104，r=0.999 9，(0.020 8～4.160 0 mg·mL-1)。

1.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一樣品溶液，按上述色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，7種成分峰面積的RSD均小于3%。

1.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一藥材粉末，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，7種成分峰面積的RSD均小于3%。

1.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品溶液，分別于0，4，8，16，24，36 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，7種成分峰面積的RSD均小于3%。

1.2.9加樣回收率試驗(yàn)

分別取同一樣品6份，約1 g，精密加入混合對(duì)照品溶液，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣10 μL，7種成分含量的回收率在98%～101%之間，其RSD均小于5%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用DPS v7.05軟件分別進(jìn)行了氣候因子與淡竹葉成分含量的灰色關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 淡竹葉產(chǎn)區(qū)氣候因子

表2 淡竹葉各產(chǎn)區(qū)氣候因子

根據(jù)氣象資料統(tǒng)計(jì)平均值，淡竹葉不同產(chǎn)區(qū)各氣候因子差異見表2。各產(chǎn)地間氣候條件差異明顯，年平均氣溫相差14 ℃，1月份均溫相差29.8 ℃，7月份均溫相差5.7 ℃，年降水量相差1 163.5 mm，年日照時(shí)數(shù)相差1 511 h，無霜期相差254 d。

2.2 各產(chǎn)地淡竹葉有效成分含量分析

分別取14個(gè)產(chǎn)地的淡竹葉樣品，按“1.2.4供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定7種有效成分的含量，結(jié)果見表3。

2.3 氣候因子與淡竹葉含量灰色關(guān)聯(lián)分析

灰色關(guān)聯(lián)度分析是灰色理論的一種數(shù)據(jù)處理和分析方法，其基本思想是根據(jù)離散數(shù)列之間的幾何相似程度來判斷數(shù)列之間的關(guān)聯(lián)度大小，其要求的樣本數(shù)相對(duì)較少，可在多個(gè)因素中分析母因素與子因素之間的相互關(guān)系[8，9]。本研究把淡竹葉有效成分視為母因素，將各地氣候生態(tài)因子作為子因素。

表3 不同產(chǎn)地淡竹葉中7種有效成分的含量 /mg·g-1

灰色關(guān)聯(lián)度的計(jì)算：

(1)對(duì)單位不同或初值不同的序列作關(guān)聯(lián)度分析時(shí)，一般要做均值化或初值化預(yù)處理，使之無量綱化、規(guī)一化。

數(shù)據(jù)初值化處理：

(1)

yi(i=1，2，…，N)分別是母因素和各子因素的初值化序列。

(2)設(shè)母因素序列x0：x0={x0(k)|k=1，2，…，n}

(2)

其中ρ為分辨系數(shù)(0≤ρ≤1)。其作用在于提高灰色關(guān)聯(lián)度之間的差異顯著性。一般取ρ=0.5，ρ越小，分辨能力越強(qiáng)。

(3)對(duì)各點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度ξ(k)(k=1，2，…，n)求平均值：

(3)

則ri稱為子因素序列xi與母因素序列x0的灰色關(guān)聯(lián)度。它描述了子因素xi對(duì)母因素x0的影響程度，ri越大影響就越大。

根據(jù)氣候因子與淡竹葉含量數(shù)據(jù)，運(yùn)用DPS v7.05軟件進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析，其灰色關(guān)聯(lián)度計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 氣候因子與淡竹葉7種化學(xué)成分的灰色關(guān)聯(lián)度

由于反式對(duì)香豆酸、異葒草苷、葒草苷、日當(dāng)藥黃素、牡荊苷、異牡荊苷和木犀草苷是淡竹葉中目前所能同步檢測(cè)到的7個(gè)成分，本文以此評(píng)價(jià)各氣候因子對(duì)淡竹葉中化學(xué)成分含量的影響。結(jié)果顯示出一定的規(guī)律：

各氣候因子對(duì)淡竹葉中反式對(duì)香豆酸含量的影響依次為：年降水量>7月份均溫>年平均氣溫>1月份均溫>無霜期>年日照時(shí)數(shù)

各氣候因子對(duì)淡竹葉中異葒草苷含量的影響依次為：年平均氣溫>1月份均溫>年降水量>7月份均溫>無霜期>年日照時(shí)數(shù)

各氣候因子對(duì)淡竹葉中葒草苷含量的影響依次為：7月份均溫>年降水量>年平均氣溫>年日照時(shí)數(shù)>1月份均溫>無霜期

各氣候因子對(duì)淡竹葉中日當(dāng)藥黃素含量的影響依次為：年平均氣溫>1月份均溫>7月份均溫>無霜期>年降水量>年日照時(shí)數(shù)

各氣候因子對(duì)淡竹葉中牡荊苷含量的影響依次為：7月份均溫>年日照時(shí)數(shù)>1月份均溫>無霜期>年平均氣溫>年降水量

各氣候因子對(duì)淡竹葉中異牡荊苷含量的影響依次為：7月份均溫>年平均氣溫>年日照時(shí)數(shù)>1月份均溫>年降水量>無霜期

各氣候因子對(duì)淡竹葉中木犀草苷含量的影響依次為：7月份均溫>年降水量>年平均氣溫>1月份均溫>無霜期>年日照時(shí)數(shù)

分析結(jié)果顯示關(guān)聯(lián)值均較高，說明這些氣候因子與淡竹葉的化學(xué)成分含量關(guān)系密切。其中，年降水量是影響反式對(duì)香豆酸含量的主導(dǎo)因子，灰色關(guān)聯(lián)度為0.420 2；年平均氣溫和1月份均溫是影響異葒草苷含量的主導(dǎo)因子，灰色關(guān)聯(lián)度分別為0.400 7和0.396 6；7月份均溫是影響葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷和木犀草苷含量的主導(dǎo)因子，灰色關(guān)聯(lián)度分別為0.385 4、0.493 8、0.556 4和0.480 7；影響日當(dāng)藥黃素含量的主導(dǎo)因子是年平均氣溫。綜上所述，7月份采收期的平均氣溫對(duì)淡竹葉中黃酮類成分的累積影響最大，其次為年平均氣溫、降水量和1月份平均溫度，由于淡竹葉喜陰，生長(zhǎng)環(huán)境較為陰濕，因此無霜期和年日照時(shí)數(shù)影響較??；降水量可能對(duì)有機(jī)酚酸類成分的成分影響較大。

3 討論與結(jié)論

淡竹葉中化學(xué)成分含量與氣候因子之間的關(guān)系密切，但自然生態(tài)因子各因素之間的關(guān)系是灰色的。因此，很難用簡(jiǎn)單的統(tǒng)計(jì)方法分析各因子之間的主次關(guān)系?；疑P(guān)聯(lián)分析是以分析系統(tǒng)中主行為因子與相關(guān)行為因子的關(guān)系的密切程度，從而來判斷引起該系統(tǒng)發(fā)展的主要因素和次要因素為主要內(nèi)容，以系統(tǒng)內(nèi)各因子之間的灰色關(guān)聯(lián)度為依據(jù)，比較灰色關(guān)聯(lián)度的大小，來確定主要影響因子和次要因子。灰色系統(tǒng)方法是對(duì)系統(tǒng)動(dòng)態(tài)過程發(fā)展態(tài)勢(shì)的定量比較分析技術(shù)，適用于部分信息已知、部分信息未知的不確定性系統(tǒng)，因此，在分析植物與環(huán)境的關(guān)系時(shí)結(jié)論可靠，并能反映實(shí)際情況[10-14]。分析結(jié)果顯示，各氣候因子與淡竹葉中化學(xué)成分的含量之間灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)在0.269 2～0.556 4之間，表明所選各氣候因子與淡竹葉次生代謝產(chǎn)物的積累有一定的聯(lián)系，但是整體區(qū)分度不是特別明顯，可見淡竹葉的生長(zhǎng)和次生代謝產(chǎn)物的積累影響因素較多，并不是明顯受某一因素單一影響。氣候因子對(duì)淡竹葉中化學(xué)成分含量的影響力大小為：7月份均溫>年平均氣溫>年降水量>1月份均溫>無霜期>年日照時(shí)數(shù)。

其中，7月份的平均氣溫對(duì)淡竹葉中黃酮類成分的含量影響較為明顯，說明熱量條件對(duì)于一些黃酮類物質(zhì)的積累有重要影響。7月份已接近淡竹葉傳統(tǒng)采收期，也是其生長(zhǎng)發(fā)育最旺盛的時(shí)候。但是淡竹葉中異葒草苷的含量受7月份氣溫的影響不大，而受年平均氣溫的影響較大。此外，反式對(duì)香豆酸的含量受降水量的影響明顯大于7月份的平均溫度。說明不同的次生代謝產(chǎn)物的合成對(duì)相同的氣候因子相應(yīng)并不相同。

降水量的大小可以決定植物生長(zhǎng)土壤中水分含量和環(huán)境的濕潤(rùn)程度，并且對(duì)植物蒸騰作用和生長(zhǎng)發(fā)育有一定的影響，而對(duì)光合作用影響較小。淡竹葉喜陰涼氣候，多生長(zhǎng)在山坡林下及陰濕處，因此，降水以保證淡竹葉生長(zhǎng)環(huán)境的濕度，但是由于自然環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定性和自身調(diào)節(jié)能力，降水量只能在一定程度上影響淡竹葉中化學(xué)成分的含量。

日照是植物光合作用的必要條件，因此對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累也有重要的影響。年日照時(shí)數(shù)和緯度的高低有著密切的聯(lián)系，但由于淡竹葉多生長(zhǎng)在林下，周圍多高大的喬木或灌木遮擋，因此，日照時(shí)數(shù)對(duì)淡竹葉中成分含量影響不大。

無霜期是制約植物對(duì)光、熱資源利用的重要因素，其長(zhǎng)短決定了淡竹葉生長(zhǎng)期的長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的成分，對(duì)無霜期的長(zhǎng)短響應(yīng)值不同，推測(cè)與次生代謝產(chǎn)物合成的時(shí)間和途徑不同有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過研究收集不同產(chǎn)區(qū)的淡竹葉藥材并測(cè)定其中的化學(xué)成分，就化學(xué)成分的種類而言，僅略有差異。本實(shí)驗(yàn)僅研究了淡竹葉中7種次生代謝產(chǎn)物對(duì)不同氣候因子的響應(yīng)，但對(duì)其遺傳信息和其他自然因素如土壤因子等尚未涉及。不同的植物對(duì)氣候因子的響應(yīng)程度不同，同一植物中不同的化學(xué)成分與氣候因子的關(guān)聯(lián)度亦不同。因此，在研究藥材質(zhì)量、尋找道地產(chǎn)區(qū)和開展藥材種植研究時(shí)，可采用本實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)其主要?dú)夂蛴绊懸蜃舆M(jìn)行初步的分析和探討。

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GrayrelationanalysisforqualityandmainclimaticfactorsofHerbaLophatheri

SHAO Ying，WU Qi-nan，YUE Wei，ZHOU Jing

(SchoolofPharmacy，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Climate factors play an important role in the growth and the contents of effective constituents of Herba Lophatheri.In order to find the high quality production place，protect and utilize the resources of the herbs effectively，the high-performance liquid chromatography combined with the gray relation analysis were used to reveal the content differences of seven effective constituents in Herba Lophatheri from fourteen production areas.The results indicate that rainfall was the leading climatic factor that influenced the content of phenolic acid，meanwhile July average temperature and annual average temperature were the factors that effected the content of flavonoid.As a result，Rainfall，July average temperature and annual average temperature could be regarded as the reference indexes of finding and developing the genuine producing area of Herba Lophatheri.This research may provide the scientific basis and references for the reasonable protection and development of the resources，the research on GAP，and the raw material quality assurances of the Chinese patent drugs.

Herba Lophatheri； effective constituent； climate factor； gray relation

2012-11-28)

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江蘇省教育廳產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(JHZD09-11)，江蘇省高等學(xué)?！爸兴庂Y源化學(xué)研究”優(yōu)秀科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2011)項(xiàng)目，江蘇省“六大人才高峰”支撐項(xiàng)目(2010)資助。

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吳啟南，Tel：(025)85811507，E-mail:qnwyjs@163.com