HPLC測定赤芝水提取物中靈芝酸A含量

盧端萍，陳碩，王勇，蔣婷婷

(1.福建省藥品檢驗所，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

HPLC測定赤芝水提取物中靈芝酸A含量

盧端萍1*，陳碩1，王勇1，蔣婷婷2

(1.福建省藥品檢驗所，福建 福州 350001；2.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001)

目的：建立赤芝水提取物中靈芝酸A的含量測定方法。方法：采用C8柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)，以乙腈-0.1%醋酸進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長：256 nm，柱溫：22 ℃。結(jié)果：樣品中靈芝酸A分離較好，靈芝酸A的線性范圍為15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0)，平均回收率為99.4%。結(jié)論：不同產(chǎn)地的赤芝水提取物中靈芝酸A含量有一定的差別，但該法簡便、易行，為赤芝水提取物質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

高效液相；赤芝水提取物；靈芝酸A

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganodermalucidum(Leyss ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子實體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘的功能。用于心神不寧，失眠心悸，肺虛咳喘，虛勞短氣，不思飲食[1]。靈芝中主要含有多糖[2-5]、三萜[6-9]、核苷[10]、生物堿[11]、黃酮[7]、氨基酸及微量元素等多種化學(xué)成分，具有護(hù)肝、抗炎、抗高血壓、抗腫瘤、降血脂、免疫調(diào)節(jié)[12]等功能。赤芝水提取物是靈芝類保健食品的主要原料之一，目前靈芝類產(chǎn)品質(zhì)量控制大多用紫外分光光度法測定總?cè)苹虼侄嗵呛縖13-14]，但紫外分光光度法專屬性不強(qiáng)；有文獻(xiàn)[15-16]報道采用核苷類成分作為靈芝類產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)，但真菌類藥用植物中均有核苷類成分，因此核苷類成分也不適宜作為靈芝類保健食品的質(zhì)控指標(biāo)。三萜類成分作為靈芝的主要活性成分之一[17-19]，有必要對其含量進(jìn)行測定，也有文獻(xiàn)報道[20-25]采用高效液相色譜法測定靈芝子實體或靈芝孢子粉中靈芝三萜類成分的含量。作者以靈芝的主要功效成分——靈芝三萜中含量較高的靈芝酸A作為質(zhì)控指標(biāo)，建立了赤芝水提物中靈芝酸A的含量測定方法，為靈芝類保健食品的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀(島津公司)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，超純水器(賽多利斯)。

1.2 試藥

靈芝酸A對照品(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所，純度>98%)，赤芝水提取物D1～D10(福建仙芝樓生物科技有限公司在全國不同產(chǎn)地收集靈芝子實體后，采用相同的提取工藝，即水提、濃縮、干燥制得)。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Agilent ZORBAX SB C8(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)；以乙腈為流動相A，0.1%醋酸為流動相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速為1mL·min-1；檢測波長為256 nm。柱溫：22 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按靈芝酸A計算應(yīng)不低于5 000。在此色譜條件下，樣品中靈芝酸A與其他組分分離效果較好，見圖1。

表1 梯度洗脫程序

A.靈芝酸A對照品;B.赤芝水提取物樣品；1.靈芝酸A圖1 赤芝水提取物及對照品HPLC圖

2.2 對照品溶液的制備

取靈芝酸A對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含靈芝酸A 90 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品0.2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理10 min，放冷，加甲醇定容至刻度，濾過，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取靈芝酸A對照品適量，加甲醇分別制成濃度為15.32，30.64，61.28，153.2，306.4 μg·mL-1的溶液，分別吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積(mAU)為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的對照品濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=10.655X+1.55，r=1.000 0，表明靈芝酸A在15.32～306.4 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.5 重復(fù)性試驗

取同一批號的赤芝水提取物(D1)樣品6份，分別制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，測得靈芝酸A平均含量為8.69 mg·g-1，RSD=0.35%，表明該法具有良好的重復(fù)性。

2.6 加樣回收試驗

取已知含量的同一批號赤芝水提取物(D1)樣品，采用加樣回收試驗，精密加一定量靈芝酸A對照品，按供試品溶液的制備方法和色譜條件測定，并計算回收率，結(jié)果見表2。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液分別于0，2，4，8，16，24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定靈芝酸A含量，結(jié)果RSD=0.67%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 靈芝酸A回收率試驗

注：靈芝酸A對照品加入量均為0.924 0 mg

2.8 樣品測定

對10批赤芝水提取物樣品按上述含量測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。

表3 赤芝水提物10批樣品含量測定結(jié)果 /mg·g-1

3 討論

3.1 流動相的選擇

實驗曾采用乙腈-水梯度洗脫，結(jié)果分離效果較差，靈芝酸A對照品峰形很差，后采用乙腈-2%醋酸[17]梯度洗脫，結(jié)果靈芝酸A色譜峰中含有一較小的雜質(zhì)峰，導(dǎo)致回收率偏低，經(jīng)調(diào)節(jié)流動相不同比例，分離效果仍不理想，后采用本文流動相梯度洗脫程序，考察了不同濃度的醋酸(0.1%，0.5%，1%，2%)，結(jié)果顯示醋酸濃度對分離結(jié)果影響較大，隨著醋酸濃度增大，靈芝酸A與雜質(zhì)峰分離越差，本實驗流動相中醋酸濃度定為0.1%。

3.2 柱溫選擇

本實驗曾考察不同柱溫(22，25，30 ℃)分離效果影響，結(jié)果表明柱溫對分離效果影響很大，柱溫為30 ℃時，靈芝酸A與雜質(zhì)峰分離不開，柱溫25 ℃時，分離效果有所改善，當(dāng)柱溫設(shè)為22℃時，靈芝酸A與前后雜質(zhì)峰均能較好地分離。

3.3 提取溶劑的選擇

曾考察甲醇和三氯甲烷兩種提取溶劑，以甲醇為提取溶劑，靈芝酸A含量較高；以三氯甲烷作為提取溶劑時，雜質(zhì)較少，但回收率偏高，故本實驗采用甲醇為提取溶劑。

3.4 提取時間的選擇

曾對其提取時間進(jìn)行考察(10，15，20，25 min)，結(jié)果超聲提取10 min，樣品中靈芝酸A已提取完全。

從以上測定結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地的赤芝水提取物中靈芝酸A含量有一定差別，可能系靈芝不同培養(yǎng)基質(zhì)、生長環(huán)境、采收季節(jié)等因素影響所致。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：174-175.

[2] 何云慶，李榮芷.靈芝肽多糖的化學(xué)研究[J].中草藥，1994，25(8):395-397.

[3] 陳敬華，張俐娜，余登壽，等.靈芝菌絲體多糖的化學(xué)組成和溶液性質(zhì)[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2000，21(6):961-964.

[4] Miyazaki T，Nishjima M.Studies on fungal polysaccharides 17.Structure examination of a water-soluble，antitumor polysaccharide of Ganoderma lucidum[J].Chem Pharm Bull，1981，29:3611-3616.

[5] 趙長家 何云慶.赤芝菌絲體活性多糖的分離、純化及結(jié)構(gòu)研究[J].中藥材，2002，25(4):252-254.

[6] 陳若蕓，于德泉.赤芝孢子粉三萜化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1991，26(4)：257-263.

[7] 劉思好，王艷，何蓉蓉.靈芝的化學(xué)成分[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2008，25(3)：183-187.

[8] 郝瑞霞，張勁松，唐慶九.靈芝子實體中兩個新的天然三萜類化學(xué)成分的分離、純化和鑒定[J].菌物學(xué)報，2006，25(4):599-602.

[9] 王芳生，蔡輝，楊俊山，等.赤芝子實體中三萜化學(xué)成分的研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1996；31(3)：200-204.

[10] 任為之，姜雯.毛細(xì)管電泳法測定靈芝中核苷類成分的含量[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2009，7(7)：25-27.

[11] 余競光，陳若云，姚志熙，等.薄蓋靈芝化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報，1990，25(8):612-616.

[12] 林志彬.靈芝的現(xiàn)代研究[M].第三版.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2007：199-288.

[13] 陳冠州，梁慧敏，謝意珍.紫外分光光度法測定破壁靈芝孢子粉提取物總?cè)坪縖J].微生物學(xué)雜志，2011，31(1)：91-94.

[14] 王旭，邸峰.紫外分光光度法測定靈芝菌絲體發(fā)酵液中多糖的含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，1997，3(5)：39-40.

[15] 嚴(yán)華，張聿梅，宋金翠.靈芝膠囊中腺苷、腺嘌呤的TLC鑒別及腺苷的HPLC法含量測定[J].藥物分析雜志，2008，28(11)：1800-1803.

[16] 宋細(xì)忠，習(xí)梅蘭.HPLC法同時測定靈芝浸膏片中尿苷和腺苷的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，23(1)：62-63.

[17] Liu RM，Zhong JJ.Ganoderic acid Mf and S induce mitochondria mediated apoptosis in human cervical carcinoma HeLa cells[J].Phytomedicine，2011，18(5)：349-355.

[18] 黃宗銹，陳冠敏，李曄，等.靈芝三萜對化學(xué)性肝損傷保護(hù)作用研究[J].預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志，2010，26(11)：929-930.

[19] Dudhgaonkar S，Thyagarajan A，Sliva D.Suppression of the inflammatory response by triterpenes isolated from the mushroom Ganoderma lucidum.[J].Int Immunopharmaco1，2009，9(11)：1272-1280.

[20] Gao JJ，Nakamura N，Min BS，et al.Quantitative determination of bitter principles in specimens of Ganoderma lucidum using high-performance liquid chromatography and its application to the evaluation of ganoderma products[J].Chem Pharm Bull，2004，52(6)：688-695.

[21] 楊娟娟，李曄，魏巧容，等.反相高效液相色譜法測定靈芝子實體總靈芝酸A 的含量[J].福建醫(yī)藥雜志，2011，33(3)：56-58.

[22] 王筱婧，林煥冰，徐江，等.HPLC法和UV-VIS法測定靈芝孢子粉中靈芝三萜及靈芝多糖的含量[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2009，15(31)：128-130.

[23] 丁平，張丹雁，徐鴻華.RP-HPLC法測定不同部位靈芝中靈芝酸B含量[J].中草藥，2001，32(4)：310-312.

[24] 蔡輝，王芳生，許莉，等，反相高效液相色譜法測定赤芝中靈芝酸的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2000，11(35)：64-66.

[25] 丁平，曾元兒.產(chǎn)地及生長期對靈芝中靈芝酸B含量的影響[J].中藥材，1999，22(6)：271-272.

DeterminationofGanodericAcidAinGanodermalucidumWaterExtractsbyHPLC

LU Duan-ping*，CHEN Shuo，WANG Yong，JIANG Ting-ting

(1.FujianInstituteforDrugControl，F(xiàn)uzhou350001，China； 2.FujianProvincialHospital，F(xiàn)uzhou350001，China)

Objective：To establish a method for determination of ganoderic acid A inGanodermasinensis water extracts by using high performance liquid chromatograph with Diode array detector.Methods：A C8column(250 mm×4.6 mm，3.5 μm)was used，the mobile phase consisted of acetonetrile-0.1% acetic acid by gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 256 nm and column temperature was maintained at 22 ℃.Results：The calibration curves of ganoderic acid A was linear in the range of 15.32～306.4 μg·mL-1(r=1.000 0).The average recovery was 99.4%.Conclusion：There is some difference in ganoderic acid A content of different originGanodermalucidumwater extracts，but this method is simple and reliable for quality control ofGanodermalucidumwater extracts.

Ganodermalucidumwater extracts； HPLC； Ganoderic acid A

2012-10-11)

*

盧端萍，Tel:(0591)87622209，E-mail：ldp18@tom.com