植物粗提物殺滅滇重樓根莖線蟲的研究△

蘇豹，楊志雷，楊永紅，*，劉君英，劉毅，管開云，韋建榮

(1.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650118；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)生物多樣性和病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.中國科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

植物粗提物殺滅滇重樓根莖線蟲的研究△

蘇豹1，楊志雷2，楊永紅1，2*，劉君英2，劉毅2，管開云3，韋建榮1

(1.云南白藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650118；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 教育部農(nóng)業(yè)生物多樣性和病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；3.中國科學(xué)院 昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

目的：研究黃柏、雷公藤等16種植物粗提液對課題組分離、鑒定和培養(yǎng)的與滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.根莖腐爛有密切關(guān)系的主要害蟲小桿線蟲Rhabditissp.的毒殺作用。方法：各種植物汁液原液配成10倍、50倍、100倍、500倍的濃度梯度，用浸液法測試殺線效果。結(jié)果：藥效試驗(yàn)顯示16種植物粗提液均有毒殺效果；馬纓丹花葉、萬壽菊、杜鵑粗提液在72h后，對小桿線蟲的致死率分別為71.4%～92.0%、83.7%～91.4%、73.3～89.0%。結(jié)論：植物殺線蟲物質(zhì)的成份和活性不僅與提取的植物種類、部位有關(guān)，也與植物新鮮度、粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、提取液濃度及其作用線蟲時(shí)間等因素也不同程度地影響著植物殺線蟲物質(zhì)的作用。

滇重樓；根莖腐爛；小桿線蟲；植物粗提物

滇重樓ParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.是延齡草科(Trilliaceae)重樓屬(Paris)植物，分布于云南、貴州和四川，生長在海拔1 400～3 100 m的常綠闊葉林、云南松林、竹林、灌叢或草坡中，根莖入藥，有清熱解毒，消腫止痛，涼肝定驚之功效，用于疔腫癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐等癥[1]。滇重樓作為中藥材，其在我國有著悠久的藥用歷史，自古以來就有許多關(guān)于它的記載，是云南白藥、宮血寧、奪命丹等一些重要中成藥和新藥的主要原料之一[2]。

由于近年來對滇重樓需求量逐年增加，野生藥源遠(yuǎn)不能保障市場需要，加之亂采濫挖，忽視對滇重樓資源的保護(hù)和繁育，野生資源遭到嚴(yán)重破壞；另外，重樓藥用部位根莖的自然生長十分緩慢，逐年的大量采挖已使野生重樓資源日趨枯竭。人工栽培是緩解滇重樓資源緊張的有效途徑，但在人工栽培過程中發(fā)現(xiàn)，滇重樓根莖根極易遭受病蟲害侵染，尤以根莖腐爛病最為嚴(yán)重。

目前，對滇重樓的人工繁殖技術(shù)已進(jìn)行了大量的探索，主要集中在種子繁殖、組織培養(yǎng)、切塊繁殖等方面，但對滇重樓根莖病害研究甚少，尤其是缺少滇重樓病蟲害及其防治的相關(guān)研究。我們從滇重樓腐爛根莖中分離并鑒定得到小桿線蟲(Rhabditissp.)、類符蟲兆(FolsominaonychiurinaDenis)、羅賓根螨(RhizoglyphusrobiniClaparede)、吸螨(BdellaLatreille)和卡氏白線蚓(FridericiacarmichaeliStephenson)及土壤昆蟲幼蟲等[4～9]。本研究對我們分離、鑒定和培養(yǎng)的與滇重樓根莖腐爛有密切關(guān)系的主要害蟲小桿線蟲Rhabditissp.，用16種植物粗提液進(jìn)行藥效試驗(yàn)，為在人工繁殖過程中出現(xiàn)的根莖腐爛問題和病蟲害的防治提供一定的依據(jù)和措施。

1 材料與方法

1.1 材料

小桿線蟲Rhabditissp.：本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和培養(yǎng)；

供試植物：選擇一些對線蟲有毒的植物，詳見表1，由本課題組采集、鑒定。

1.2 方法[10]

用浸液法研究殺線效果，即將100頭左右的線蟲浸入一定濃度的藥液中，每種藥液設(shè)定5個(gè)濃度梯度，用無菌水作對照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

沖洗干凈采集的植物，晾去表面水滴，剪碎，勻漿，可加少量的無菌水，勻漿用三層濾布擠壓過濾出植物液汁，各取15 mL放在三角瓶中封好，高壓滅菌，取出用黑色塑料袋包好放在冰箱中保存。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1)各種植物汁液原液配成10倍、50倍、100倍、500倍的濃度梯度，分裝在小試管中，以無菌水作為對照。

2)用消毒液和無菌水沖洗線蟲三次即可，線蟲懸浮液濃度為200條/0.1 mL。

3)加入0.1 ml的線蟲懸浮液到小試管中，4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h各觀察一次，為計(jì)數(shù)方便，每次從試管中取搖勻的線蟲懸浮液0.1 mL，計(jì)數(shù)活蟲數(shù)和死蟲數(shù)。

4)計(jì)算出死亡率和更正死亡率，判別線蟲死亡方法為線蟲呈僵直不動(dòng)為死蟲，呈彎曲蠕動(dòng)狀態(tài)的為活蟲。死亡率和更正死亡率計(jì)算方法[11]。

5)采用Finney機(jī)率值分析法與最小二乘法計(jì)算毒力回歸方程和LT50。數(shù)據(jù)組間經(jīng)t檢驗(yàn)檢測顯著性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過軟件EXCEL和DPS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 供試植物

2 結(jié)果與分析

在測定藥劑效果時(shí)，一般采用以不同劑量與相應(yīng)的死亡率做成劑量—死亡率的毒力曲線，但該曲線是S形，不易精確求得LD50或LT50。所以將劑量換成對數(shù)值表示，將死亡用幾率值表示，即可精確求出LD50或LT50。LD50或LT50最能反映藥劑毒力的大小，是一個(gè)比較精確、穩(wěn)定和可靠數(shù)值，該數(shù)值越小，效力越大。

由表2對各植物粗提液進(jìn)行的毒力回歸分析以及求得的LT50，即殺死50%線蟲所需的時(shí)間，可以看出抑制線蟲效果依次是：馬纓丹花葉原液、萬壽菊花原液、杜鵑花原液、馬纓丹花10×、杜鵑花10×、三尖衫葉原液、三尖衫葉10×、萬壽菊葉原液、萬壽菊根原液、雷公藤葉原液、馬纓丹花葉50×、萬壽菊花10×、包菜葉汁原液、杜鵑花50×、細(xì)辛葉原液、煙葉原液、細(xì)辛葉10×、水飛薊原液、曼佗羅葉原液、煙葉原液、夾竹桃葉原液、包菜葉汁500×、蓖麻枝葉原液、蓖麻枝葉100×。結(jié)果說明，除了植物殺線蟲物質(zhì)的成份和活性不僅與提取的植物種類、部位有關(guān)，也與植物新鮮度、粉碎度、提取時(shí)間、提取溫度、提取液濃度及作用時(shí)間等因素有關(guān)。

目前，只研究了16種植物粗提液對線蟲的毒殺效果，并未對其化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析。因此，有待對其化學(xué)成分定性定量分析以及線蟲毒殺機(jī)理進(jìn)一步研究。

表2 線蟲累計(jì)死亡率與時(shí)間的效應(yīng)關(guān)系

續(xù)表

3 討論

滇重樓是云南省地道稀缺名貴藥材，是云南白藥主要原料之一，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，近年來云南省重樓的馴化栽培面積累計(jì)達(dá)40～66.67 hm2。其中，云南白藥集團(tuán)中藥材優(yōu)質(zhì)種源為原料的生產(chǎn)企業(yè)用量大幅度增加，種植力度也在加大，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，近10個(gè)繁育有限責(zé)任公司的重樓種植面積占重樓種植總面積的50%以上。人們對滇重樓栽培開展了大量研究，主要集中在種子繁殖、組織培養(yǎng)、切塊繁殖等方面。首先，由于滇重樓種子有二次休眠的特性，打破休眠直至萌發(fā)需要較長時(shí)間，因此利用種子繁殖，技術(shù)復(fù)雜、生長周期長；組織培養(yǎng)繁殖方面，雖然許多科研機(jī)構(gòu)已做了大量實(shí)驗(yàn)研究，如用滇重樓的莖、葉、花蕾等作外植體，目前仍極難誘導(dǎo)出愈傷組織，一直未有組培繁殖成功的報(bào)道；切塊繁殖方面，近年取得一定進(jìn)展。然而，切塊繁殖的材料，其上根腐病發(fā)生非常嚴(yán)重，但研究報(bào)道甚少，因?yàn)榈嶂貥潜旧淼纳L習(xí)性和根莖構(gòu)造等原因，滇重樓易發(fā)生根腐病，而滇重樓主要是以根莖入藥，因此根腐病造成的損失就更為直接和嚴(yán)重，致使對根腐病的防治已成為滇重樓能否成功栽培的關(guān)鍵要素之一，化學(xué)防治不能從根本上解決問題，生物防治成為必然趨勢，生物多樣性、套種將成為可行之路。本研究對滇重樓進(jìn)行田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，滇重樓的根腐病發(fā)病率一般為50%，嚴(yán)重者可達(dá)到87.7%，成為制約該原料內(nèi)在質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵因子之一。

3.1 害蟲與病害嚴(yán)重程度的關(guān)系

本研究通過接種不同數(shù)量表面消毒的小桿線蟲，以及從田間病根上分離的結(jié)果來看，蟲口數(shù)量大，發(fā)病快，發(fā)病嚴(yán)重，蟲口數(shù)量小，發(fā)病就較輕和發(fā)病速度慢。本研究還沒有對線蟲以外的其他可能病原物進(jìn)行致病性測定，但接種小桿線蟲顯示出該線蟲與根腐病存在密切關(guān)系。這種蟲口密度大，發(fā)病重的原因可能是盡管線蟲表面經(jīng)過消毒處理，但不能排除線蟲體內(nèi)攜帶病原物的可能性，即消毒把線蟲體外的潛在病原物殺死，但不能殺死蟲體內(nèi)的病原物，當(dāng)線蟲侵入重樓根莖時(shí)，病原物從線蟲口腔排除從而侵染根莖。即小桿線蟲可能是一種傳播媒介。

3.2 線蟲的防治

雖然目前還不能明確確定小桿線蟲為病原線蟲，但它接種的結(jié)果表明，它與重樓根腐病關(guān)系十分密切。因此，開展防治藥劑篩選對控制根腐病亦有直接作用。近年來，利用植物天然活性物質(zhì)防治植物寄生線蟲是國外研究的熱點(diǎn)，但就如何提高植物殺線蟲物質(zhì)的活性研究，國內(nèi)鮮有資料報(bào)道。本試驗(yàn)進(jìn)行了萬壽菊、包菜、馬纓丹、柏木、三尖衫等16種植物粗提液對線蟲的毒殺效果測試，期望開發(fā)殺線劑新資源和人工合成高效低毒、無公害低殘留物的殺線劑增添了新路徑；另，根據(jù)化感效應(yīng)采用，選擇對其有毒殺作用的植物進(jìn)行間作，預(yù)期會(huì)起到一定效果。

我們對滇重樓根腐病相關(guān)的生物因子進(jìn)行了研究，根據(jù)結(jié)果，初步認(rèn)為，造成的原因既有環(huán)境因素，也有生物因素。如根莖和土壤嚴(yán)格消毒后接種的植株在不適環(huán)境中仍出現(xiàn)此類病害，在接種消毒的小桿線蟲試驗(yàn)時(shí)，不接種的空白對照在田間也發(fā)生類似根腐病。田間的光照條件對病害的嚴(yán)重程度也有一定的影響。本試驗(yàn)殺線效果最好的是馬纓丹花葉原液、三尖衫葉原液和萬壽菊花原液，72 h對線蟲毒殺效果分別為92.0%、93.8%、91.4%。馬纓丹的殺線效果很好，國內(nèi)外對其殺線效果的研究較多，本試驗(yàn)也得到同樣的效果。因此，作者提出以生物防治為主的綜合防治措施，為下一步的田間防治試驗(yàn)提供科學(xué)根據(jù)。

本研究所用的植物粗提液有一定的毒殺線蟲效果，重樓屬于喜陰植物，可間植高稈作物和藤本作物遮蔭。作者認(rèn)為，將重樓與這些具有毒殺線蟲的植物間作套種來防治病蟲害可減輕根腐病的為害。因?yàn)樘烊恢参飺]發(fā)性物質(zhì)或根分泌物和水浸出物對于已侵入寄主體內(nèi)潛伏侵染的線蟲，將會(huì)發(fā)揮其特有的滲透抑制效果，或者能誘發(fā)土壤線蟲的天敵菌的旺盛生長，改變線蟲的生境條件，控制線蟲種群的增長率。關(guān)于這些植物源的粗提液活性測定問題，由于沒有測定它們的有效成份，不能計(jì)算出它們的半致死濃度或劑量，故只采用了粗提液的不同稀釋濃度，計(jì)算線蟲半致死時(shí)間，這也是一種常見的計(jì)算方法。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010，183.

[2] 侯玉平，胡曉立，楊斌，等.滇重?fù)袎K繁殖不定芽發(fā)生的組織學(xué)研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004，26(6)：544-547.

[3] 李群，陳麗萍，葛方蘭.重樓屬植物愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)[J].四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，29(1)：120-122.

[4] 楊永紅，陸峻波，王明輝，等.從文獻(xiàn)分析看我國重樓研究進(jìn)展[J].中藥材，2008，31(1):165-177.

[5] 楊永紅，劉君英，王明輝，等.滇重樓根莖腐爛與小桿線蟲的關(guān)系[J].中藥材，2008，31(10):7-9.

[6] 楊永紅，嚴(yán)君，劉君英，等.滇重樓根莖腐爛的調(diào)查及其主要害蟲研究[J].中藥材，2009，32(9)：1342-1346.

[7] 孫桂麗，陳有為，夏國興，等.云南重樓植物內(nèi)生真菌的分離及抗菌活性篩選[J].微生物學(xué)雜志，2005，25(6)：59-62.

[8] 趙明，賀聲蓉，陳小靜，等.產(chǎn)甾體皂甙華重樓內(nèi)生菌的篩選與鑒定[J].微生物學(xué)報(bào)，2005，45(5)：776-779.

[9] 曹曉冬，周立剛，徐利劍，等.滇重樓內(nèi)生真菌的生物學(xué)性狀及其甾體化合物含量[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，33：125-128.

[10] 方中達(dá).植病研究方法(第三版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.

[11] 張志祥，徐漢虹，程?hào)|美.EXCEL在毒力回歸計(jì)算中的應(yīng)用[J].昆蟲知識(shí)，2003，26(6)：624-626.

TheVirulenceofVariousPlantWaterExtractsAgainstRhabditissp.fromRotRhizomeofParispolyphyllavar.yunnansensis

SU Bao1，YANG Zhi-lei2，YANG Yong-hong1，2*，LIU Jun-ying2，LIU Yi2，GUAN Kai-yun3，WEI Jian-rongi1

(1.YunnanBaiyaoGroupLimitedCompany，YunnanProvinceKunming650118，China；2.KeyLaboratoryforAgriculturalBiodiversityandPestManagementofChinaEducationMinistry；KeyLaboratoryforPhytopathologyinYunnanProvince；CollegeofPlantProtection，YunnanAgricultureUniversity；YunnanProvinceKunming650201，China；3.KunmingInstituteofBotany，theChineseAcademyofSciences，YunnanProvinceKunming650204，China)

Objective:To determine the poison effect of 16 kinds of plants water extracts which includePhellodendronamurense，Tripterygiumwilfondiiandetal，on main pestsRhabditissp.，which were isolated，identified and cultured fromParispolyphyllaSmith var.yunnansensis(Franch.)Hand.-Mazz.，related to the herb-Paris rhizome rot.Methods:The poison effect were tested with various plant water extract with concentrate 10 times，50 times and 100 times，500 times gradient，using the immersion method.Results:Efficacy trials showed 16 kinds of plant crude extract has the poison effect.There was distinctive difference among the nematicidal efficacy of various extracts of plants and parts.The water extracts ofLantanaindica，Tageteserecta，Rhododendronyunnanensehad the killing rates of 71.4%～92.0%，83.7%～91.4%，73.3～89.0% respectively in 72 h.Conclusion:Nematicides plant material composition and activity relates to the extraction of plant species and parts，freshness of plant，crushing ratio，extraction time，extraction temperature，the concentration of the extract and action time also affects the result of kill nematodes material in different degrees .

Parispolyphyllavar.yunnanensis； Rootstock rot； Nematode； Biological control

2013-05-07)

△

國家工業(yè)和信息化部中藥材扶持項(xiàng)目資助(2008年度)

*

楊永紅，E-mail：yyh831994@163.com