補(bǔ)充肌酸對(duì)老齡大鼠骨骼肌收縮特性的影響①

楊霖，高前進(jìn)

肌肉衰減癥(sarcopenia)是由增齡引起骨骼肌肌肉量減少，導(dǎo)致肌肉力量減弱和活動(dòng)受限，受傷的危險(xiǎn)性增高[1]。事實(shí)上從40歲起，人的骨骼肌就開始不斷衰減，并且衰減速度隨增齡而增加。有研究報(bào)道70歲以下老年人群中有13%～24%患有肌肉衰減癥，而80歲以上的老年人中則超過(guò)50%[2]，給社會(huì)及家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。

目前治療肌肉衰減癥的常用辦法是抗阻力訓(xùn)練和注射睪酮[3-4]。然而，睪酮對(duì)老年人有副作用，不主張廣泛使用[5]。服用肌酸可能是一種安全、有效且經(jīng)濟(jì)的治療手段，補(bǔ)充肌酸能夠減少因增齡引起的肌肉質(zhì)量下降，增加肌肉力量[6]和Ⅱ型肌纖維直徑[7]。

有眾多研究反復(fù)報(bào)導(dǎo)肌酸能夠增加35歲以下成年人肌肉功能，尤其結(jié)合抗阻力訓(xùn)練效果更好[8]。然而，肌酸對(duì)老年人骨骼肌影響的研究卻較少，而且大多數(shù)研究側(cè)重于補(bǔ)充肌酸后的生化變化[9-10]，對(duì)于補(bǔ)充肌酸前后肌肉收縮特性的變化缺乏深入的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察補(bǔ)充肌酸前后骨骼肌收縮特性等參數(shù)的變化，尋求提高老年人骨骼肌功能的方法，對(duì)提高老年人生活質(zhì)量、節(jié)省醫(yī)療資源具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，同時(shí)對(duì)老年肌肉衰減癥治療方法的研究也具有一定的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠20只，18月齡(相當(dāng)于人55～60歲[11])，體重(404±8.10)g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，選用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干飼料喂養(yǎng)，自由飲食，自然光照，室溫18～22℃，濕度40%～45%。隨機(jī)分為對(duì)照組和肌酸補(bǔ)充組(0.3 g/kg?d[12])，每組10只。飼養(yǎng)6周于末次灌胃后取材。實(shí)驗(yàn)在河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 大鼠體重與肌肉濕重測(cè)量

6周后戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，分別稱量對(duì)照組和肌酸補(bǔ)充組大鼠體重。取右側(cè)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌測(cè)量濕重后用于肌酸和磷酸肌酸的測(cè)量；左側(cè)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌用于離體收縮功能測(cè)量。心臟取血2 ml，3000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，-70℃保存。

1.3 肌磷酸肌酸、肌酸的測(cè)定

1.3.1 儀器和試劑 惠普1050型高效液相色譜儀，包括惠普1050系列自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)、四元梯度泵、DAD二極管陣列檢測(cè)器及HP3D化學(xué)工作站軟件：美國(guó)惠普公司；Eyela FD凍干機(jī)：日本Rikakikai公司；Nissei AM-6高速組織勻漿機(jī)：日本Ace公司；METTLER電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；J2-21型低溫超速離心機(jī)：美國(guó)Beckman公司；超低溫冰箱：日本三洋；ZBE30-107制冰機(jī)：ZIEGRA公司。

分析純磷酸和磷酸肌酸：美國(guó)SIGMA公司；分析純?chǔ)?硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid,TBA)、高壓液相級(jí)乙腈、NaH2PO4、NaOH、HClO4：天津化學(xué)試劑二廠。

1.3.2 色譜條件固定相 色譜柱為YWG-C 18(5 μm，250×4.6 mm I.D.)：大連化學(xué)物理研究所；流動(dòng)相：所有流動(dòng)相均用雙蒸水配置。流動(dòng)相A為含有0.1 mol/L NaH2PO4和2 g/L TBA的混合液，然后用2 mol/L NaOH調(diào)pH至5.5；流動(dòng)相B為流動(dòng)相A和乙腈按75∶25體積比混合的混合液。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天流動(dòng)相經(jīng)孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾。磷酸肌酸與肌酸的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；檢測(cè)靈敏度0.01 AUFS，檢測(cè)進(jìn)樣量為5 μl。

1.3.3 標(biāo)本處理 從液氮中取出骨骼肌標(biāo)本，置于凍干機(jī)中過(guò)夜凍干，然后做成凍干粉。把肌肉粉末倒入小試管中，編號(hào)，加蓋密封，置于-80℃低溫冰箱中保存。測(cè)定前準(zhǔn)確稱取骨骼肌凍干粉60 mg左右，放入5 ml聚乙烯微離心管中，然后滴入預(yù)冷的濃度為0.4 mol/L的過(guò)氯酸2 ml，用預(yù)冷的電動(dòng)高速勻漿機(jī)勻漿2 min，然后低溫離心10 min；吸取400 μl上清液放入另一試管中，加入2 mol/L的KHCO380 μl，然后再低溫離心10 min，取上清液200 μl保存于-80℃低溫冰箱中待分析[13]。

1.4 收縮功能測(cè)量[14-15]

剪開后肢小腿皮膚，輕輕游離比目魚肌，用0號(hào)絲線行近心端肌腱結(jié)扎，置于氧合的Krebs-Henseleit溶液中清洗肌肉表面血液，水平置于容量為1 ml的肌槽中；近心端肌腱用絲線結(jié)扎固定于等長(zhǎng)張力傳感器(TB-651日本光電)的不銹鋼鉤上，遠(yuǎn)心端肌肉則被夾于彈簧夾中。用27℃Krebs-Henseleit溶液按10 ml/min行非循環(huán)灌流。灌流液組成：120.0 mmol/L NaCl， 4.7 mmol/L KCl， 1.2 mmol/L NaH2PO4， 1.2 mmol/L MgSO4，2.5 mmol/L CaCl2，20.0 mmol/L NaHCO3，10.0 mmol/L葡萄糖。以95%O2和5%CO2的混合氣體充分氧合，使pH維持在(7.4±0.20)。電刺激器(SEN-3301，日本光電)輸出脈寬20 ms、間隔20 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激。先平衡約20 min，然后以0.1 mm增量，逐步拉伸比目魚肌至等長(zhǎng)收縮張力為最大時(shí)的肌肉初長(zhǎng)Lmax位置，平衡10 min，記錄肌肉長(zhǎng)度與張力，接下來(lái)所有值的測(cè)量都在肌肉初長(zhǎng)度Lmax位置測(cè)量。再以0.5 V的步幅，逐步降低刺激電壓至3 V，在每一新電壓刺激點(diǎn)平衡3 min后，記錄收縮張力。

強(qiáng)直收縮時(shí)，以脈寬5 ms、間隔40 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激45 s，使肌肉產(chǎn)生高頻強(qiáng)直收縮，強(qiáng)直收縮最大張力用P0表示。比目魚肌試驗(yàn)完成后，取趾長(zhǎng)伸肌，按相同方法固定與平衡，采用脈寬10 ms、間隔20 ms與電壓為6 V的方波脈沖刺激。

10 min后，肌肉抗疲勞性測(cè)量使用低頻疲勞方案30 Hz，300 ms，每次刺激2 s，共5 min。為了更好地比較肌肉抗疲勞特征，肌肉張力值被標(biāo)準(zhǔn)化，都用百分比表示，以初始測(cè)得的張力值為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，所有刺激產(chǎn)生的張力除以初始張力值，乘以100%。刺激時(shí)間點(diǎn)，前60 s分別在第8、16、24、32、40、48、56秒刺激，然后分別在第60、120、180、240、300秒刺激。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用濾紙吸干肌肉表面附著的水分并稱質(zhì)量，再按文獻(xiàn)[16]公式計(jì)算每一肌肉的橫截面積，張力數(shù)據(jù)用橫截面積作歸一化處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 體重與肌肉濕重

喂養(yǎng)前大鼠體重為(404.20±8.10)g。喂養(yǎng)6周后，對(duì)照組大鼠隨年齡增長(zhǎng)體重出現(xiàn)明顯增加，由喂養(yǎng)前的404.70 g增加到442.70 g；肌酸補(bǔ)充組體重增加更加明顯。肌酸補(bǔ)充組比目魚肌濕重和趾長(zhǎng)伸肌濕重均高于對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

2.2 肌酸和磷酸肌酸含量

喂養(yǎng)6周后，肌酸補(bǔ)充組比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌細(xì)胞中肌酸和磷酸肌酸含量增加，與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。見表2。

2.3 收縮特性

與對(duì)照組比較，肌酸補(bǔ)充組比目魚肌最大收縮力(Pt)增大，強(qiáng)直最大收縮力(P0)增大，達(dá)到最大收縮力的時(shí)間(TPT)縮短，從峰值張力舒張一半的時(shí)間(TPR50)縮短，但只有和TPR50與對(duì)照組具有顯著性差異(P＜0.05)；肌酸補(bǔ)充組趾長(zhǎng)伸肌Pt增大，P0增大，TPT縮短，與對(duì)照組具有顯著性差異(P＜0.05)。見表3。

2.4 比目魚肌、趾長(zhǎng)伸肌抗疲勞性

在前2 min，兩組張力分別降低到初始張力的(72±5.2)%和(79±4.8)%；在后3 min，對(duì)照組張力繼續(xù)降低，而肌酸補(bǔ)充組肌張力沒有進(jìn)一步降低，第5分鐘時(shí)對(duì)照組張力降到初始張力的(46±6.7)%，肌酸補(bǔ)充組張力降到初始張力的(70±6.4)%。見圖1。

肌酸對(duì)趾長(zhǎng)伸肌抗疲勞性有一定影響，但與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。5 min疲勞方案的刺激后，對(duì)照組張力降到初始張力的(47±12.8)%，肌酸補(bǔ)充組張力降到初始張力的(55±13.4)%。在開始刺激后對(duì)照組和肌酸補(bǔ)充組張力出現(xiàn)一個(gè)漸進(jìn)性的增加，這種增加持續(xù)20～30 s，然后開始降低。120 s刺激后張力已經(jīng)回落到初始張力水平(100%)。值得注意的是肌肉張力增加的幅度，對(duì)照組在第24秒時(shí)達(dá)到初始張力的(164±21)%，肌酸補(bǔ)充組達(dá)到初始張力的(190±11)%，肌酸補(bǔ)充組張力增加幅度比對(duì)照組大，具有顯著性差異(P＜0.05)。見圖2。

表1 兩組大鼠體重與肌肉濕重(g)

表2 兩組比目魚肌、趾長(zhǎng)伸肌細(xì)胞肌酸和磷酸肌酸含量(mmol/kg干重)

表3 肌酸補(bǔ)充對(duì)比目魚肌、趾長(zhǎng)伸肌收縮特性的影響

圖1 兩組比目魚肌抗疲勞性

圖2 兩組趾長(zhǎng)伸肌抗疲勞性

3 討論

本研究主要檢查6周肌酸補(bǔ)充對(duì)老年大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌收縮特性、抗疲勞特性的影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)每天0.3 g/kg體重的肌酸劑量，喂養(yǎng)6周大鼠體重增加，比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌濕重增加，肌肉中肌酸和磷酸肌酸含量比正常對(duì)照組增加(P＜0.05)。由此看來(lái)，補(bǔ)充肌酸對(duì)老齡骨骼肌效果顯著。

2000年Tarnopolsky曾提出假設(shè)，補(bǔ)充肌酸對(duì)老年人的影響也許比年輕人更大[17]，后來(lái)大量支持性文章報(bào)道老年人肌細(xì)胞內(nèi)源性總肌酸含量比年輕人低，含有較低內(nèi)源性肌酸的個(gè)體比含有較高內(nèi)源性肌酸的個(gè)體對(duì)補(bǔ)充肌酸反應(yīng)更大[18-19]。已有研究證明Ⅱ型肌纖維橫斷面積減少是增齡引起肌肉量減少最主要的反應(yīng)，肌肉活檢發(fā)現(xiàn)ⅡA和ⅡB肌纖維橫截面積隨增齡降低15%～25%[20]，肌酸具有恢復(fù)老齡肌肉Ⅱ型肌纖維的功效。很多研究認(rèn)為補(bǔ)充肌酸促進(jìn)肌肉肥大的機(jī)制主要包括：肌酸使肌細(xì)胞腫脹，這可作為一個(gè)信號(hào)減少蛋白水解和氨基酸氧化，改變肌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，增加衛(wèi)星細(xì)胞有絲分裂活動(dòng)[21]，因此服用肌酸后肌肉濕重增加，肌纖維增粗?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為肌酸提高骨骼肌功能是由于增強(qiáng)磷酸肌酸能量系統(tǒng)，正如本實(shí)驗(yàn)觀察到的肌酸和磷酸肌酸含量增高，磷酸肌酸能量系統(tǒng)功效增強(qiáng)使ATP生成增多，進(jìn)而個(gè)體運(yùn)動(dòng)能力增加[22]，受試者能承受高強(qiáng)度、長(zhǎng)時(shí)間的負(fù)荷。

肌肉收縮特性研究使用離體比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌30℃灌流方法，測(cè)量其單次收縮和強(qiáng)直收縮。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)比目魚肌Pt和P0增大，TPT及TPR50縮短，但只有TPR50與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)。趾長(zhǎng)伸肌Pt和P0增大、TPT縮短，且與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P＜0.05)，時(shí)間參數(shù)TPR50雖縮短，但與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，6周的肌酸補(bǔ)充使老年大鼠骨骼肌收縮特性均出現(xiàn)良好的變化。但是，肌酸對(duì)趾長(zhǎng)伸肌影響更顯著，Pt、P0和TPT與對(duì)照組有顯著性差異。分析其原因可能是增齡引起的肌肉量減少主要是由于Ⅱ型肌纖維橫截面積減少，而肌酸能幫助保持Ⅱ型肌纖維質(zhì)量不隨增齡減少。Sipila等報(bào)道，在不進(jìn)行訓(xùn)練刺激的情況下，肌酸補(bǔ)充能夠增加Ⅱ型肌纖維直徑[23]。趾長(zhǎng)伸肌主要含有Ⅱ型肌纖維，是典型的快肌，肌酸補(bǔ)充能幫助保持趾長(zhǎng)伸肌肌纖維質(zhì)量不隨增齡減少，磷酸肌酸系統(tǒng)功效增強(qiáng)。在運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中肌酸常被運(yùn)動(dòng)員用作提高短時(shí)間爆發(fā)力項(xiàng)目的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)品，對(duì)快肌(Ⅱ型肌纖維)效果顯著。也許這些正是趾長(zhǎng)伸肌Pt、P0顯著增強(qiáng)和TPT縮短的原因。

6周的肌酸補(bǔ)充使比目魚肌TPR50顯著降低的最可能的解釋是肌漿網(wǎng)Ca2+泵活動(dòng)的改變。Ca2+泵活動(dòng)時(shí)所需ATP主要來(lái)自磷酸肌酸，肌肉磷酸肌酸增加可導(dǎo)致Ca2+泵活動(dòng)增強(qiáng)。在培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞，補(bǔ)充肌酸使磷酸肌酸增加后，肌漿網(wǎng)Ca2+泵攝Ca2+能力明顯增強(qiáng)[24]。對(duì)肌酸補(bǔ)充顯著降低比目魚肌的TPR50，而趾長(zhǎng)伸肌的TPR50沒有出現(xiàn)顯著性變化，可能的解釋是肌酸對(duì)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌舒張時(shí)間的影響可能與不同肌纖維類型上Ca2+泵的特性有關(guān)，慢肌和快肌上表達(dá)不同的Ca2+泵亞型，不同Ca2+泵亞型對(duì)調(diào)節(jié)表現(xiàn)出不同的敏感性[25]。所以，雖然補(bǔ)充肌酸導(dǎo)致在比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌相似的磷酸肌酸增加，但是兩種肌肉類型Ca2+泵對(duì)磷酸肌酸的反應(yīng)卻不同。

肌酸對(duì)比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌產(chǎn)生不同影響也表現(xiàn)在對(duì)肌肉抗疲勞性影響方面。肌酸補(bǔ)充后趾長(zhǎng)伸肌抗疲勞性顯著提高，而趾長(zhǎng)伸肌的抗疲勞性沒有明顯提高。實(shí)驗(yàn)采用的低頻刺激方案由重復(fù)的亞極量強(qiáng)度強(qiáng)直刺激組成。刺激導(dǎo)致的低頻疲勞使無(wú)機(jī)磷酸鹽和H+增加[26]；無(wú)機(jī)磷酸鹽和H+降低肌原纖維對(duì)Ca2+的敏感性，由此導(dǎo)致疲勞性的張力降低[27]。這種類型的疲勞方案導(dǎo)致的張力降低也與肌肉的有氧供能能力相關(guān)。高有氧供能能力的肌肉更具有抗疲勞性。肌酸補(bǔ)充后比目魚肌抗疲勞性增強(qiáng)與增加的有氧供能能力相關(guān)，與Brannon[18]報(bào)道的結(jié)果相一致。Brannon的研究證實(shí)補(bǔ)充肌酸增加了慢縮的比目魚肌有氧供能能力，而沒有增加快縮的股外側(cè)肌的有氧能力，說(shuō)明影響是有肌纖維類型依賴性的。這些研究結(jié)果也許可以解釋為什么本研究觀察到肌酸使比目魚肌抗疲勞性顯著增加而趾長(zhǎng)伸肌沒有顯著增加。

但是在疲勞測(cè)試中，肌酸增加了趾長(zhǎng)伸肌肌張力短時(shí)間增加的幅度(圖2)，肌肉張力增加的幅度，對(duì)照組在第24秒時(shí)達(dá)到初始張力的(164±21)%，肌酸補(bǔ)充組達(dá)到初始張力的(190±11)%，肌酸補(bǔ)充組張力增加幅度比對(duì)照組大(P＜0.05)。產(chǎn)生這種影響的機(jī)制我們認(rèn)為是由于增加了磷酸肌酸，而趾長(zhǎng)伸肌是快肌，對(duì)磷酸肌酸非常敏感，磷酸肌酸能增強(qiáng)快肌短時(shí)間爆發(fā)式用力的能力。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充肌酸能夠安全地增強(qiáng)老年骨骼肌的收縮力量，使肌肉肥大，增加肌肉的抗疲勞能力，不同的肌纖維類型影響不同。結(jié)合文獻(xiàn)與我們的研究結(jié)果，我們強(qiáng)烈推薦肌酸是安全、經(jīng)濟(jì)、有效的營(yíng)養(yǎng)劑，可以延緩因老齡引起的肌肉廢用，尤其推薦在服用時(shí)結(jié)合抗阻力訓(xùn)練效果更好。將來(lái)的研究應(yīng)該關(guān)注影響肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入骨骼肌的因素，例如肌酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的濃度及口服吸收量，還應(yīng)研究老年人服用肌酸時(shí)理想的劑量和服用次數(shù)，以及與蛋白質(zhì)結(jié)合使用等問題，以期為老年骨骼肌康復(fù)作出貢獻(xiàn)。總之，補(bǔ)充肌酸對(duì)老年骨骼肌具有良好的營(yíng)養(yǎng)作用。

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