蟾酥注射液的急性和亞慢性毒性研究

鐘舒紅，胡庭俊，郝利華，趙 暉，鄧彥宏，何家康

（1．廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西 南寧530005；2．中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 海淀100081；3．吉林大學畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春130062）

蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufobufogargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufomelanostictus Schneider）的干燥分泌物［1］，具有強心、抗腫瘤、抗疲勞、增強免疫力、鎮(zhèn)咳等藥理作用［2］。在人類醫(yī)學，蟾酥主要用于防治惡性腫瘤、止痛麻醉治療、抗感染治療、防治白細胞減少癥和治療周圍性面神經(jīng)麻痹等［3］。在獸醫(yī)臨床，蟾酥常用于治療豬白痢、豬破傷風、豬肺疫、豬喘氣病和豬流行性感冒等［4］。蟾酥為《中華人民共和國藥典》二零零零年版一部標注毒性的15味常用有毒中藥之一，其中毒機理主要是蟾毒配基引起迷走神經(jīng)過度興奮，致房室傳導阻滯和心率失常［5］。毒性強弱與特殊基因相關(guān)。蟾酥制劑的毒性因提取方法不同而有較大的差異［6－7］。蟾酥注射液為蟾酥經(jīng)水提醇沉制備而得，主要有效成分為水溶性生物堿。本研究旨在考察蟾酥注射液的臨床毒性作用，為蟾酥注射液的安全用藥提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥品 蟾酥注射液，廣西北斗星動物保健品有限公司提供，規(guī)格：10mL：蟾酥0．02g。

1．2 試驗動物 Wistar大鼠，7、8周齡，雌雄各半，體重80～100g，購自吉林大學醫(yī)學部實驗動物中心，動物合格證號：081013006。試驗期間飼喂大鼠全價顆粒料，室溫控制在18℃～25℃，相對濕度為55%～65%，室內(nèi)無對流風。

1．3 儀器 全自動血細胞分析儀（CELL－DYN400，美國雅培公司）；Technicon全自動生化分析儀（RA－1000，美國泰爾康公司）；輪轉(zhuǎn)式切片機（YD－1508型，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠）；電子分析天平（BS－210S型，北京賽多利斯天平有限公司）。

1．4 急性毒性試驗 選取大鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半，用藥前6h禁食不禁水。在預(yù)試基礎(chǔ)上確定各組大鼠用藥量，相鄰兩組間劑量的公比級數(shù)K值為1．2。1～5組大鼠用藥劑量分別為70、84、101、121、145mg／kg。生理鹽水將藥液稀釋至合適的濃度并按10mL／kg體重的劑量腹腔注射。

1．5 亞慢性毒性試驗 大鼠買回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，選用體重為80～100g的大鼠120只，稱重隨機分為4組，每組30只，雌雄各半。第1～3組為試驗組，即 高 劑 量 組 （1／10LD50）、中 劑 量 組 （1／20 LD50）、低劑量組（1／40LD50），第4組為空白對照組。每天同一時間腹腔注射蟾酥注射液（10mL／kg體重），對照組給予相同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥4周，再飼養(yǎng)2周作為恢復(fù)期，各組均采用相同的飼養(yǎng)管理方式。檢測指標：（1）血常規(guī)及血清生化指標。試驗的28d，各組以斷頭處死20只大鼠，全血作血常規(guī)檢驗，血清作生化指標檢驗。（2）臟器系數(shù)：肉眼觀察各組組織臟器的病變后，稱取主要臟器心臟、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、睪丸的濕重，根據(jù)臟器系數(shù)＝臟器濕重×100／體重，計算各臟器的臟器系數(shù)。（3）病理組織學觀察：取高、中、低劑量組動物的各內(nèi)臟器官，以甲醛固定，作組織切片，觀察病理組織學變化。

1．6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 大鼠增重、血常規(guī)指標、血清生化指標、臟器系數(shù)均用單因子方差分析檢驗各組的差異性，并借助統(tǒng)計分析軟件SPSS 16．0來完成。

2 結(jié)果

2．1 急性毒性試驗 高劑量組動物出現(xiàn)的中毒癥狀主要表現(xiàn)為精神抑郁、很快進入麻醉狀態(tài)，無前期興奮，呼吸加深隨后逐漸減慢，伏臥不起，直至死亡。剖檢死亡大鼠各臟器，肝臟出現(xiàn)少量淤血、壞死點，腸系膜充血，其他被檢臟器如心、脾、肺和腎未見異常。病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)，肝臟中央靜脈有輕微充血，而肝索和靜脈竇正常，肝細胞無異常變化。心臟、腎臟和肺臟等均未見明顯病理變化。見表1和表2。

表1 蟾酥注射液經(jīng)大鼠腹腔給藥LD50劑量對數(shù)

表2 蟾酥注射液對大鼠增重的影響（Mean±SD，n＝30）

從表1可以看出，蟾酥注射液經(jīng)腹腔給藥，其LD50為102．65mg／kg，LD50的95% 的可信限為93．92mg／kg～112．21mg／kg。

2．2 亞慢性毒性試驗

2．2．1 日常觀察與增重情況 低劑量組大鼠在4周的給藥期間，活動正常、毛發(fā)光潤、攝食，飲水、糞便均正常，未發(fā)現(xiàn)中毒癥狀，動物無一死亡。高、中劑量組在長期連續(xù)給藥4周后，部分大鼠出現(xiàn)中毒典型癥狀表現(xiàn)，如食欲不振、毛色晦暗、無光澤、精神委頓、糞便不成形等，在整個試驗期間也未出現(xiàn)大鼠死亡。染毒后第14天和第21天，高、中劑量組增重與對照組比較差異有顯著意義（P＜0．05），低劑量組與對照組比較差異不顯著（P＞0．05），結(jié)果見表2。

2．2．2 血常規(guī)檢查 高、中劑量組 WBC顯著高于對照組（P＜0．05）；高劑量組大鼠PLT與對照組比較差異顯著（P＜0．05），其他各組 WBC、紅細胞（RBC）和PLT值等指標與對照組比較均無顯著性差距（P＞0．05），見表3。

2．2．3 血清生化指標檢查大鼠高、中、低劑量組ALB與對照組比較有顯著性差異（P＜0．05）；高、中劑量組總膽紅素（T－BIL）、尿素氮（BUN）、肌 酐（CREA）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）與對照組比較差異顯著（P＜0．05）。有關(guān)恢復(fù)期，除了高劑量組的BUN、CREA與對照組差異有顯著外，高劑量組的其他指標以及中、低劑量組的各項指標與對照組比較差異不顯著（P＞0．05），結(jié)果見表4和表5。

2．2．4 臟器指數(shù) 停藥時，高、中劑量組雌、雄大鼠的肝臟系數(shù)比對照組大，并有顯著性差異（P＜0．05）；高劑量組雌、雄大鼠的脾臟系數(shù)、高劑量組雌性大鼠的子宮系數(shù)以及高、中劑量組雌、雄大鼠的腎臟系數(shù)均比對照組小，并有顯著性差異（P＜0．05）；其他均無顯著性差異（P＞0．05），結(jié)果見表6?；謴?fù)2周后，高劑量組的肝臟系數(shù)比對照組大、腎臟系數(shù)比對照組小，并有顯著性差異（P＜0．05），結(jié)果見表7。說明蟾酥注射液高、中劑量下可使肝臟腫大、腎臟萎縮，高劑量下可使脾臟和雌性動物的子宮萎縮。恢復(fù)期后中劑量組動物各臟器系數(shù)與對照組比較無顯著性差異，說明上述副作用停藥后可恢復(fù)，而高劑量組停藥后肝、腎功能的恢復(fù)不佳。

表3 蟾酥注射液對大鼠血常規(guī)指標的影響（Mean±SD，n＝30）

2．2．5 病理學檢查 當亞慢性毒性試驗結(jié)束時（28 d），各組隨機取大鼠10只進行病理剖檢，發(fā)現(xiàn)高、中劑量組大鼠肝、脾、腎、雌性大鼠的子宮呈暗紅色，無光澤感，部分器官有瘀血現(xiàn)象。

給藥4周后，高劑量組有11只動物、中劑量組有4只動物肝組織出現(xiàn)輕度淤血和中度的炎性細胞浸潤?；謴?fù)期后中劑量組動物肝被膜完整，肝實質(zhì)正常，肝小葉界限可辨，肝血竇中有血細胞，細胞質(zhì)中有較豐富的糖原，匯管區(qū)無炎性細胞，屬正常肝；而高劑量組動物肝組織仍有輕度的炎性細胞浸潤。給藥4周后后，高劑量組有10只動物、中劑量組有3只動物腎臟組織出現(xiàn)萎縮和退行性變化。組織學檢查發(fā)現(xiàn)有明顯的腎小管壞死，部分小管結(jié)構(gòu)紊亂較嚴重，空泡變性明顯，有的出現(xiàn)間質(zhì)灶性纖維化?；謴?fù)期后高、中劑量組動物腎小管結(jié)構(gòu)較為清晰，形態(tài)正常，無異常病理表現(xiàn)。高劑量組病理學檢查還發(fā)現(xiàn)部分大鼠脾臟、部分雌性大鼠子宮萎縮、增長受抑制等現(xiàn)象，但停藥恢復(fù)期后能恢復(fù)正常。其他各組動物各臟器質(zhì)地未見異常，組織學檢查未見明顯病變。

表4 蟾酥注射液對大鼠血清生化指標的影響 （Mean±SD，n＝30）

表5 蟾酥注射液停藥恢復(fù)2周后大鼠血清生化指標的影響 （Mean±SD，n＝10）

表6 蟾酥注射液停藥時大鼠主要臟器系數(shù)的影響 （Mean±SD，n＝20）

表7 蟾酥注射液停藥恢復(fù)期后大鼠主要臟器系數(shù)的影響 （Mean±SD，n＝10）

3 討論

蟾酥為《中華人民共和國藥典》二零零零年版一部標注毒性的15味常用有毒中藥之一［8］。蟾酥的毒性與其提取方法、活性成分的組成與含量有著密切的關(guān)系。賀石林等［6］研究蟾酥的不同制劑對小鼠的LD50：蟾酥粗制品為40mg／kg，醇提取物為208 mg／kg，水提取物為900mg／kg。金其泉等［7］測定蟾皮制劑的急性毒性，蟾皮制劑Ⅰ號（水溶性成分）臨床用量的1 500倍小鼠尾靜脈給藥未見中毒；蟾皮制劑Ⅱ號（水脂混合成分）毒性較大，LD50靜脈注射為3．81±0．22mg／kg，腹腔注射為26．27±0．3 mg／kg，說明蟾酥制劑工藝、不同的提取方法、不同的活性成分，LD50相差較大。本制劑蟾酥注射液為蟾酥經(jīng)水提醇沉精制而成的注射液，主要成分為水溶性生物堿。試驗結(jié)果表明，其LD50為102．65 mg／kg（以蟾酥計），該劑量為豬臨床推薦用量（0．2 mg／kg體重）的513倍。表明蟾酥注射液按臨床推薦劑量使用安全性較高。

亞慢性毒性試驗結(jié)果表明，蟾酥注射液高、中劑量組在用藥10d后采食量明顯下降、體重增長緩慢。至試驗結(jié)束時，與對照組比較增重差異明顯。表明蟾酥注射液在較高劑量下［≥5．0mg／kg（以蟾酥計）］長期使用可影響動物的生長發(fā)育。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶參與體內(nèi)轉(zhuǎn)氨基作用，它們反映蛋白質(zhì)合成和分解代謝的狀況，其在血液中的變化顯示肝的健康狀態(tài)。當細胞、線粒體受損時，ALT和AST逸出細胞進入血液，使其血液濃度升高，血液中ALT與AST活性升高［9］。因此，血清酶活性的升高表示機體組織器官受損［4］。試驗結(jié)果表明，各給藥組血清中ALT水平顯著性（P＜0．05）高于對照組，結(jié)合病理剖檢和組織切片檢查，說明蟾酥注射液長期大劑量使用對肝臟有損害作用。

高、中劑量組BUN、CREA水平與對照組比較差異顯著（P＜0．05），表明蟾酥注射液對腎臟功能也有一定的影響。病理剖檢和臟器系數(shù)檢查證實，腎臟組織出現(xiàn)萎縮和退行性變化。組織學檢查發(fā)現(xiàn)有明顯的腎小管壞死，部分小管結(jié)構(gòu)紊亂較嚴重，空泡變性明顯，有的出現(xiàn)間質(zhì)灶性纖維化。

綜上所述，蟾酥注射液其毒性作用的靶器官主要是肝臟和腎臟，出現(xiàn)肝臟腫大和腎臟萎縮等現(xiàn)象，以肝細胞腫脹、變性、增生、腎小管壞死為特征性病變。在恢復(fù)期末，對余下動物進行相同項目觀察和檢測，發(fā)現(xiàn)中、低劑量組未見明顯毒性反應(yīng)和病理變化，肝臟和腎臟功能恢復(fù)較好，表明該劑量（≤5．0 mg／kg）條件下藥物對試驗動物造成的損傷性病變是可逆的，不會產(chǎn)生延遲性毒性反應(yīng)。而較高劑量（≥10．0mg／kg）的恢復(fù)效果不佳。

綜上可以看出，蟾酥注射液大劑量長期應(yīng)用時會對肝臟、腎臟造成輕微的炎癥，提示在臨床上應(yīng)用時一定要注意劑量和療程，以免起到負面的作用。

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