慢性心衰大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)GABAB 受體介導(dǎo)的心血管效應(yīng)

王仁俊，溫美玲，寇正涌，李 華，郝錫聯(lián)，趙 卓，周 革，周曉馥

（吉林師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000）

多種心血管疾?。ü谛牟?、高血壓等）的終末階段都表現(xiàn)為慢性心力衰竭，是嚴(yán)重危害人類健康的心臟疾病.雖然臨床上采用β受體阻斷劑、腎素－血管緊張素醛固酮系統(tǒng)阻滯劑等對此有一定的治療作用，但其確診后四年病死率仍高達(dá)50%，目前仍缺乏有效的治療手段.

有研究顯示，慢性心衰的重要病理特征是交感傳出神經(jīng)興奮性增強［1］.導(dǎo)致心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮性增強的主要原因可能與中樞作用機制改變有關(guān)［2－5］.但是，在心衰狀態(tài)下延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（RVLM）內(nèi)突觸遞質(zhì)與交感神經(jīng)活動增強的確切機制目前還不清楚.眾所周知，延髓頭端腹外側(cè)區(qū)是調(diào)節(jié)交感緊張性的重要神經(jīng)核團，許多神經(jīng)遞質(zhì)參與該部位的調(diào)節(jié)作用.目前認(rèn)為抑制性反應(yīng)主要是由γ－氨基丁酸（GABA）參與完成，并由GABAA和GABAB兩種受體介導(dǎo)，其中GABAB受體激活后通過G蛋白及第二信使系統(tǒng)，如cAMP或IP3介導(dǎo)K＋通道開放或Ca2＋通道關(guān)閉.在突觸后膜，K＋通道開放可誘導(dǎo)緩慢抑制性突觸后電位，而大多數(shù)分布在突觸前膜的GABAB受體主要通過關(guān)閉Ca2＋通道調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放.因此，無論在突觸前膜或突觸后膜的GABAB受體均參與介導(dǎo)抑制性效應(yīng).有研究表明RVLM的GABA緊張性抑制作用可通過GABAB受體產(chǎn)生［6］，而慢性心衰大鼠RVLM由GABAB受體介導(dǎo)的緊張性抑制作用是否發(fā)生改變，其內(nèi)在機制如何尚未見報道，本文對此進(jìn)行了研究，以探尋防治慢性心力衰竭的新策略和新方法.

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體重180～200g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司.

1.2 藥品試劑與實驗設(shè)備

試劑：阻斷劑CGP－35348、巴氯芬、α－氯醛糖、滂胺天藍(lán)購于Sigma－Aldrich公司；肝鈉素購于北京鼎國生物技術(shù)公司.設(shè)備：多道生理記錄儀、大鼠腦立體定位儀、微操縱器.

1.3 心衰動物模型的建立

采用冠脈結(jié)扎方法誘導(dǎo)建立大鼠慢性心衰模型.在乙醚麻醉下將大鼠仰位固定于手術(shù)臺，自左側(cè)3～4肋間開胸，暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠脈左前降支，以0號線立即結(jié)扎冠脈；將心臟送回胸腔，并擠出胸腔內(nèi)血液和氣體，迅速關(guān)閉胸腔，開胸時間不超過30s.假手術(shù)組僅置縫線而不結(jié)扎冠脈.術(shù)后前3d，肌注青霉素.術(shù)后6～8周對假手術(shù)對照大鼠與心衰模型大鼠進(jìn)行數(shù)據(jù)檢測.

1.4 實驗分組

動物隨機分為兩大組：（1）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348組，其中分假手術(shù)組（n＝7）和心衰組（n＝8）.（2）延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬組，其中分假手術(shù)組（n＝6）和心衰組（n＝8）.

1.5 左心室舒張末期壓（LVEDP）、左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）、血壓（BP）和心率（HR）的記錄

腹腔注射烏拉坦（0.75g／kg）和α－氯醛糖（70mg／kg）麻醉，如需要可靜脈補充α－氯醛糖（0.3g／kg）麻醉，右頸總動脈插管，通過壓力換能器連接到多道生理記錄儀，同步采集LVSP（左心室收縮壓）、LVEDP和±dp／dt等各項指標(biāo)，記錄完左心室舒張末期壓后，將聚乙烯導(dǎo)管退出心室，可進(jìn)一步記錄動脈血壓，記錄大鼠標(biāo)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，并同步得到心率.

1.6 延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射及核團定位

將動物俯臥位固定于大鼠腦立體定位儀上，參照Paxions＆Waston大鼠腦圖譜［7］，在延髓頭端腹外側(cè)區(qū)（前囟后11.9～12.7mm，L和R 2.0～2.2mm，H 8.4～8.8mm）微量注射200nL相同體積的溶劑（vehicle）人工腦脊液（pH＝7.4），并先后分別微量注射200nL GABAB受體阻斷劑或激動劑，從每次注射完成后開始計時，連續(xù)觀察BP和HR對微量注射藥物或人工腦脊液的反應(yīng)，每次給藥時間間隔30min.微注射實驗完畢，用過量麻醉劑將動物處死.將2%滂胺天藍(lán)溶液（50nL）緩慢注入延髓頭端腹外側(cè)區(qū).剪取頭顱，去除顱骨，將腦組織固定于10%甲醛溶液中，3d后作冰凍切片（厚度為30μm），染色，使用體視顯微鏡觀察藥物是否進(jìn)入延髓頭端腹外側(cè)區(qū)，定位偏離RVLM者不列入統(tǒng)計.

1.7 心肌梗死面積測定

上述實驗完成后取出心臟，－20℃保存.心肌梗死面積詳細(xì)測定步驟參見文獻(xiàn)［8］.

1.8 大鼠RVLM組織取材

用過量麻醉劑將假手術(shù)組和心衰組大鼠處死，取腦并迅速轉(zhuǎn)移至干冰上冰凍.用冰凍切片機在RVLM核團所在位置連續(xù)切6張100μm厚的腦片，用12號針頭在腦片上RVLM核團所在位置雙側(cè)總共打12個孔.針頭內(nèi)的組織即為RVLM核團組織.

1.9 Western bolt檢測

取假手術(shù)組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)腦組織分別加入蛋白提取緩沖液（10mmol／L Tris，1mmol／L EDTA，1%SDS，0.1%Triton X－100和1mmol／L PMSF），超聲粉碎，37℃孵育30min；4℃10000r／min離心2min；上清液即為全細(xì)胞蛋白，Bradford法測定蛋白濃度；各組等量蛋白樣品經(jīng)SDS－PAGE分離后，三明治法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；用封閉液（含5%脫脂奶粉TBST）室溫封閉；分別用一抗GABAB受體1a和1b亞型抗體（1∶500，rabbit polyclonal），GAPDH（1∶1000），室溫和4℃孵育過夜后，膜用TBST洗滌干凈.然后用1∶4000稀釋的紅外熒光標(biāo)記二抗（Alexa Fluor 800或Alexa Fluor 700）分別對膜避光孵育1h，利用Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白進(jìn)行檢測.

1.10 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)都用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，注射前和注射后比較的數(shù)據(jù)分析使用配對t檢驗做統(tǒng)計學(xué)處理.為比較BP和HR對微注射不同劑量激動劑或阻斷劑的組內(nèi)差異，重復(fù)檢驗ANOVA Dunnett's post hoc test.假手術(shù)組和心衰組之間原始數(shù)據(jù)和參數(shù)的相對改變采用二元ANOVA Bonferroni's post hoc test檢驗.

2 結(jié)果

2.1 心衰與假手術(shù)大鼠整體生理學(xué)指標(biāo)

大鼠心臟標(biāo)本病理分析發(fā)現(xiàn)，心衰組大鼠心臟重量、體重和肺濕重與假手術(shù)組相比明顯增加（P＜0.05），結(jié)果提示心衰大鼠出現(xiàn)水潴留.與肺淤血假手術(shù)組相比，心衰組大鼠左心室心肌梗死面積明顯增加（P＜0.05），心梗面積在30%～40%之間；假手術(shù)組大鼠左心室心肌未見明顯損傷.心衰組大鼠左心室最大收縮舒張速率（±dp／dt）明顯低于假手術(shù)組；而心衰組大鼠左室舒張末期壓卻明顯高于假手術(shù)組（P＜0.05）（見表1）.以上結(jié)果提示心衰組大鼠的心臟收縮和舒張功能減退，這些表現(xiàn)與臨床慢性心衰癥狀相近.

表1 心衰與假手術(shù)大鼠整體生理學(xué)指標(biāo)檢測結(jié)果

2.2 注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348

與溶劑對照組相比，假手術(shù)組和心衰組大鼠RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348導(dǎo)致心率和血壓呈劑量依賴性升高（P＜0.05）（見圖1），但與假手術(shù)組相比，心衰組心率和血壓升高幅度顯著減?。≒＜0.05）（見圖1）.心率和血壓對CGP－35348開始反應(yīng)的時間是2.5～3.5min，峰值出現(xiàn)在微量注射后的5～6min內(nèi)，而恢復(fù)至給藥前水平的時間是在20～25min內(nèi)，并且心衰組大鼠BP和HR的恢復(fù)時間為（22.1±1.9）min，與假手術(shù)組恢復(fù)時間（23.2±1.7）min無顯著差異（P＞0.05）.

圖1 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射CGP－35348對血壓和心率的影響

2.3 注射GABAB受體激動劑巴氯芬

與溶劑對照組相比，假手術(shù)組和心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬導(dǎo)致心率、血壓呈劑量依賴性下降（P＜0.05）（見圖2）；但與假手術(shù)組比，心衰組心率和血壓下降幅度顯著減小（P＜0.05）（見圖2）.心率和血壓對巴氯芬產(chǎn)生反應(yīng)的谷值出現(xiàn)在微量注射后的4～5min內(nèi)，而心率和血壓下降的效應(yīng)在微量注射后的25～35min內(nèi)恢復(fù)至給藥前的基線水平，并且心衰組大鼠BP和HR對延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬產(chǎn)生反應(yīng)的潛伏期（3.9±0.8）min，與假手術(shù)組潛伏期（4.1±0.7）min無明顯差異（P＞0.05）.

圖2 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)微量注射巴氯芬對血壓和心率的影響

2.4 檢測大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量

因為1a和1b兩種亞型是GABAB受體的主導(dǎo)優(yōu)勢亞型［9－10］，故分別在6只假手術(shù)組和6只心衰組大鼠中，使用Western bolt技術(shù)檢測假手術(shù)組、心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量.研究結(jié)果顯示心衰組大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量與假手術(shù)組相比發(fā)生下調(diào)（P＜0.05）（見圖3）.

圖3 假手術(shù)組與心衰組大鼠延髓頭端腹外側(cè)區(qū)GABAB受體1a和1b亞型蛋白表達(dá)量

3 討論

本項研究工作證實心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體介導(dǎo)的交感緊張性調(diào)節(jié)作用減弱.在大鼠單側(cè)RVLM微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬導(dǎo)致BP下降和HR減慢，這可能是微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬后，交感神經(jīng)的傳出活動受到抑制而引發(fā)的，該結(jié)果與Amano等人的報道相一致［11］.相比較而言，于大鼠RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑CGP－35348，卻引起HR加快、BP升高，這可能是與微量注射GABAB受體阻斷劑后，交感神經(jīng)的傳出活動去抑制有關(guān)，該結(jié)果與周蘇婭等人的報道相一致［6］.值得注意的是與假手術(shù)組相比，心衰組RVLM微量注射GABAB受體阻斷劑后心率、血壓升高幅度顯著降低，而微量注射GABAB受體激動劑巴氯芬使心率、血壓下降幅度顯著減少，結(jié)果提示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的緊張抑制作用發(fā)生鈍化.這種RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的交感縮血管緊張抑制作用的功能減弱可能是使交感神經(jīng)興奮性增強的作用機制之一.

為進(jìn)一步解釋心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱的確切機制，本文進(jìn)行了Wertern blot檢測實驗，Western blot結(jié)果顯示心衰大鼠RVLM的GABAB受體介導(dǎo)的緊張性抑制作用發(fā)生鈍化，與GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)有關(guān).此外，心衰大鼠RVLM GABAB受體功能減弱存在以下幾種可能機制：（1）在慢性心衰狀態(tài)下，某些激素或神經(jīng)遞質(zhì)水平升高，可降低RVLM內(nèi)GABAB受體的功能.（2）受體的親和力、磷酸化狀態(tài)以及亞基的組成可能與心衰大鼠RVLM內(nèi)GABAB受體功能減弱有關(guān).（3）幾種突觸遞質(zhì)效應(yīng)如：突觸前GABA合成或釋放的減少、GABA降解的增加以及GABA與其受體的異常作用都可能導(dǎo)致GABAB受體功能的改變，進(jìn)而引起交感興奮性增強.（4）心衰狀態(tài)下一氧化氮（NO）－GABA機制也可影響交感神經(jīng)的緊張性作用.

根據(jù)組織學(xué)鑒定，我們認(rèn)為在RVLM內(nèi)微量注射GABAB受體激動劑或阻斷劑所引起的BP和HR的改變，都是RVLM內(nèi)特異性的，即這些效應(yīng)并不是注射時的機械刺激或酸堿化學(xué)刺激所致，因為微量注射相同體積的人工腦脊液（pH＝7.4），對BP和HR均無明顯影響.同時該效應(yīng)與藥物擴散達(dá)到RVLM鄰近部位也無關(guān)，因為向RVLM鄰近部位注入相同體積和pH值的GABAB受體激動劑或阻斷劑，對BP和HR并無明顯影響；并且該效應(yīng)也非藥物進(jìn)入血液循環(huán)作用于其他外周器官組織所引發(fā)，因為我們直接向靜脈內(nèi)注射了2.5倍于RVLM內(nèi)微量注射最高劑量濃度的GABAB激動劑或阻斷劑，發(fā)現(xiàn)BP和HR均未發(fā)生顯著變化.

總之，本研究顯示慢性心衰狀態(tài)下RVLM內(nèi)GABAB受體介導(dǎo)的交感傳出抑制作用發(fā)生鈍化與GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)有關(guān)，結(jié)果提示RVLM內(nèi)GABAB受體功能的減弱和GABAB受體的表達(dá)量下調(diào)是心衰狀態(tài)下心血管功能異常（如交感興奮性增強等）的重要病理機制之一.

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