重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）單克隆抗體的制備

徐多多，李思靜，李芳芊，潘鵬濤，吳 靖，王 麗

（東北師范大學(xué)遺傳與細(xì)胞研究所，吉林 長(zhǎng)春 130024）

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種誘導(dǎo)血管生成及增加血管透性的重要蛋白質(zhì)，最早是在1989年由Leunq等人在牛的垂體星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中提純出來(lái)的［1］，是一種重要的促血管生成因子.研究證明它是一種同源二聚體糖蛋白［2］，由兩個(gè)相同多肽鏈通過(guò)二硫鍵構(gòu)成.細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中需要這種生長(zhǎng)因子的促進(jìn)作用，尤其是腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中更離不開(kāi)VEGF的作用.近年來(lái)許多學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血清中VEGF蛋白含量明顯高于健康人［3－5］；此外，血管的生成及細(xì)胞增生程度也與VEGF的表達(dá)水平有著密切關(guān)系［6］，且其過(guò)度表達(dá)影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲.基于以上理論基礎(chǔ)，本文應(yīng)用雜交瘤技術(shù)制備了VEGF單克隆抗體，以為開(kāi)發(fā)檢測(cè)VEGF的試劑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

雌性BALB／c小鼠，購(gòu)于吉林大學(xué)公共衛(wèi)生基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2／0）、重組質(zhì)粒pET28a（＋）－VEGF、大腸桿菌DH5α、BL21由本實(shí)驗(yàn)室保存；Ni－NTA瓊脂糖凝膠購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；IPTG購(gòu)自鼎國(guó)生物有限公司；尿素、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、咪唑、PEG4000購(gòu)自上海生工；羊抗鼠IgG－HRP二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、HAT培養(yǎng)基（50×）、HT培養(yǎng)基（50×）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司.

1.2 VEGF蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將pET28a（＋）－VEGF表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，挑取單菌落，接種至LB培養(yǎng)基中，37℃，100r／min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.第2天，接種新的LB培養(yǎng)基，200r／min擴(kuò)大培養(yǎng)4h后，加入IPTG（終濃度1mmol／L），37℃，200r／min誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收集菌體并進(jìn)行超聲破碎，8mol／L尿素溶解沉淀，4℃過(guò)夜，離心，棄沉淀留上清.將含有目的蛋白的上清液上鎳柱，分別用濃度為20，40，100，200，500mmol／L的咪唑（用8mol／L尿素溶液配制，pH＝7.4）洗脫，收集各個(gè)濃度的洗脫液，電泳分析，選出條帶比較單一的樣品收集并純化.

1.3 免疫動(dòng)物

小鼠免疫按常規(guī)方法進(jìn)行，初次免疫用30μg的VEGF蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合，乳化后免疫BALB／c小鼠.以后每隔2周，采用VEGF蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合后進(jìn)行免疫，共免疫3次.

1.4 雜交瘤細(xì)胞融合

提前兩周復(fù)蘇SP2／0骨髓瘤細(xì)胞，融合前一天取BALB／c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備飼養(yǎng)細(xì)胞.加強(qiáng)免疫3d后進(jìn)行細(xì)胞融合，將SP2／0細(xì)胞與脾細(xì)胞按1∶10的比例（體積比）于50mL離心管中混合，1min內(nèi)緩慢滴入1mL預(yù)熱的50%PEG4000，37℃水浴中靜置5min，用無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)基終止作用，離心收集細(xì)胞.首先將細(xì)胞懸于含HAT的選擇培養(yǎng)基中，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加1～2滴細(xì)胞懸液使得接種細(xì)胞密度為1～2個(gè)／孔，培養(yǎng)10d后更換HT培養(yǎng)基，兩周后，改用一般培養(yǎng)基.

1.5 雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化

待雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底面積1／10以上時(shí)，用VEGF（0.5μg／mL）包被ELISA板，用ELISA方法篩選陽(yáng)性克隆孔.同時(shí)設(shè)SP2／0骨髓瘤細(xì)胞上清液作為陰性對(duì)照.D（450）值大于或等于陰性孔的2.1倍即為陽(yáng)性孔.選取D（450）值相對(duì)較高的培養(yǎng)孔進(jìn)行克隆，采用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆，獲得能夠穩(wěn)定分泌VEGF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株.

1.6 腹水的制備、純化、效價(jià)測(cè)定及特異性驗(yàn)證

1.6.1 腹水制備

按常規(guī)方法將0.5mL無(wú)菌液體石蠟注射到小鼠腹腔，一周后，再將0.5mL雜交瘤細(xì)胞（（2～5）×106個(gè)／mL）懸液注射到小鼠腹腔.同時(shí)用SP2／0細(xì)胞制備陰性腹水.10～20d后，當(dāng)觀察到小鼠腹部明顯膨隆、波動(dòng)感明顯且小鼠狀態(tài)較差時(shí)，收集腹水.

1.6.2 腹水純化

采用G蛋白（Protein G）親和層析法對(duì)腹水抗體進(jìn)行純化.將磷酸鈉鹽結(jié)合緩沖液裝入5mL注射器中，用10mL結(jié)合緩沖液洗柱，流速為1mL／min；將腹水與結(jié)合緩沖液按照1∶2（體積比）稀釋?zhuān)蠘樱魉?mL／min，然后用10mL結(jié)合緩沖液洗柱；用Bradford試劑檢測(cè)，直到流出液中沒(méi)有蛋白為止.用洗脫緩沖液洗柱，收集樣品，－40℃保存.

1.6.3 效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法測(cè)定純化的VEGF單克隆抗體效價(jià).用制備的VEGF蛋白包被ELISA板，濃度為0.5μg／mL，每孔100μL，4℃過(guò)夜；37℃封閉1h，拍干后加入倍比稀釋的抗體100μL，另用骨髓瘤細(xì)胞制備的腹水作為陰性對(duì)照，用抗體稀釋液作為空白對(duì)照，37℃孵育1h；洗滌后加入羊抗鼠IgG－HRP，37℃反應(yīng)45min，加底物顯色，最后用2mol／L的硫酸終止反應(yīng).用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450nm處樣品（P）、陰性對(duì)照孔（N）及空白對(duì)照（B）的D（450）值，計(jì)算P／N 比值，并選定P／N≥2.1為陽(yáng)性，其中P／N≥2.1時(shí)陽(yáng)性血清的最大稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià).

1.6.4 單克隆抗體特異性驗(yàn)證

用Western blot方法對(duì)VEGF單克隆抗體的特異性進(jìn)行鑒定.首先將VEGF蛋白進(jìn)行SDS－PAGE，然后將其電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液進(jìn)行封閉，洗滌后將純化的單克隆抗體作為一抗，羊抗鼠IgG－HRP作為二抗，最后用AEC底物顯色.

2 結(jié)果

2.1 VEGF蛋白SDS－PAGE及Western blot分析

目的蛋白經(jīng)過(guò)NTA－Ni2＋親和層析及咪唑梯度洗脫后，在相對(duì)分子質(zhì)量20000～31000之間出現(xiàn)了一條單一的目的帶（見(jiàn)圖1），純度達(dá)到90%以上，滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)要求.純化后的VEGF蛋白再經(jīng)過(guò)SDS－PAGE進(jìn)行分離，將凝膠上的純化蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用商品化VEGF單克隆抗體進(jìn)行特異性分析，結(jié)果表明，純化后的VEGF蛋白在對(duì)應(yīng)位置出現(xiàn)了明顯的單一雜交條帶（見(jiàn)圖1），證實(shí)制備的VEGF蛋白具有抗原性能夠特異性識(shí)別VEGF抗體.

圖1 純化后VEGF蛋白SDS－PAGE及Western blot分析

圖2 G蛋白親和純化后腹水抗體SDS－PAGE

2.2 單克隆抗體制備純化結(jié)果

采用小鼠腹腔注射的方法制備腹水，利用IgG能與G蛋白特異性結(jié)合的特性，使IgG先吸附于瓊脂糖凝膠上，再使用洗脫緩沖液將IgG洗脫，從而達(dá)到對(duì)腹水抗體純化的目的.將洗脫液進(jìn)行SDS－PAGE分析，結(jié)果如圖2所示.從圖2中可以清晰看到抗體的輕鏈、重鏈，且雜蛋白含量非常少，表明純化后的腹水抗體純度高，可滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求.

2.3 單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA方法對(duì)純化后的腹水抗體進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3.從圖3可以看出，純化后的腹水抗體的D（450）值與陰性對(duì)照的D（450）值之比大于或等于2.1的最高稀釋倍數(shù)為1024.因此，腹水抗體純化后效價(jià)達(dá)到1∶1024.

圖3 純化后VEGF單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

圖4 Western blot鑒定制備的單克隆抗體特異性

2.4 單克隆抗體特異性鑒定

應(yīng)用Western blot方法對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行特異性分析，結(jié)果見(jiàn)圖4.結(jié)果顯示，單克隆抗體能與VEGF蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而陰性對(duì)照無(wú)特異性條帶出現(xiàn)，表明純化后的單克隆抗體能夠特異性識(shí)別目的蛋白.

3 討論

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)烈的血管生成因子，參與促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤血管生成、維持腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)等諸多生理及病理過(guò)程［8］.VEGF是肝素結(jié)合型二聚體糖蛋白，有5種剪接異構(gòu)體，分別包括121，145，165，189，206個(gè)氨基酸，其中VEGF165是體內(nèi)最豐富的亞型，具有較強(qiáng)的生物活性［9］.因此，本實(shí)驗(yàn)選擇免疫原時(shí)，采用的是VEGF165蛋白.

細(xì)胞融合是制備單克隆抗體過(guò)程中關(guān)鍵的一步，融合率高低和后續(xù)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選密切相關(guān).因此在細(xì)胞融合前要做好充足的準(zhǔn)備，如提前復(fù)蘇骨髓瘤細(xì)胞使得融合時(shí)可生長(zhǎng)到最佳狀態(tài)，提前一天制備飼養(yǎng)細(xì)胞以及免疫后的小鼠脾細(xì)胞要充分研磨等.

細(xì)胞融合后，首先使用HAT培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)阻斷其他融合細(xì)胞或未融合細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖.本實(shí)驗(yàn)主要采用間接ELISA的方法進(jìn)行篩選，并獲得了特異性及靈敏性較高的細(xì)胞株.細(xì)胞融合后選擇適合的檢測(cè)時(shí)間也是很重要的，過(guò)早會(huì)因陽(yáng)性細(xì)胞少而出現(xiàn)假陽(yáng)性，過(guò)晚可能會(huì)使檢測(cè)細(xì)胞株中混有不分泌抗體的陰性克隆細(xì)胞，而這些細(xì)胞具有代謝上的優(yōu)勢(shì)，它會(huì)與陽(yáng)性細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)成分，進(jìn)而導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞死亡.本研究是在融合后的第10天，觀察到部分雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)至孔底面積的1／10時(shí)，開(kāi)始對(duì)其進(jìn)行檢測(cè).為避免陽(yáng)性細(xì)胞株轉(zhuǎn)變成陰性，應(yīng)該在篩選出陽(yáng)性孔后盡快進(jìn)行亞克隆.另外，由于初次篩選出的雜交瘤細(xì)胞中的染色體極不穩(wěn)定，易丟失，從而喪失分泌抗體的能力，所以，一般要經(jīng)過(guò)3～4次的克隆、亞克隆才能篩選出能夠穩(wěn)定分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞.

本研究以高純度的VEGF作為抗原反復(fù)免疫小鼠，按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)篩選出1株可分泌VEGF抗體的雜交瘤細(xì)胞，并通過(guò)制備腹水的方法成功獲得了高純度的VEGF單克隆抗體.經(jīng)ELISA和Western blot檢測(cè)，抗體具有高特異性，效價(jià)達(dá)到1∶1024，為下一步開(kāi)發(fā)基于血清VEGF蛋白的檢測(cè)試劑奠定了基礎(chǔ).

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