• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化并促進(jìn)其侵襲

    2013-09-15 08:00:12李四光常遠(yuǎn)鴻劉凱歌
    關(guān)鍵詞:胎牛星狀小室

    李四光,常遠(yuǎn)鴻,劉凱歌

    (1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院,陜西西安710021;2.西安市第四醫(yī)院消化內(nèi)科,陜西西安710004;3.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,陜西西安710077)

    肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝臟正?;虿±頎顟B(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源,有實(shí)驗(yàn)表明肝癌腫瘤微環(huán)境中的肝星狀細(xì)胞可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。

    SDF-1(stromal cell derived factor-1,基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)是Cys-X-Cys類趨化蛋白,在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、歸巢等方面有多重作用。細(xì)胞趨化因子受體CXCR4是SDF-1的特異性受體,相互為一配一的唯一性配體/受體關(guān)系[2]。SDF-1結(jié)合激活CXCR4后使細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲聚合,形成假偽足,定向遷移侵襲。許多惡性腫瘤中均有CXCR4異常表達(dá)[3]。有研究揭示,CXCR4在肝癌組織中異常高表達(dá),且與預(yù)后明確相關(guān)[4];而活化的肝星狀細(xì)胞是SDF-1的主要來源[5]。本研究擬通過肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的模型,進(jìn)一步研究肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的作用與機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2和人肝星狀細(xì)胞系LX02由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。四甲基偶氮唑鹽(MTT)/二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜),Transwell小室(Milliproe公司)。鼠抗人p-REK、鼠抗人t-ERK抗體及鼠抗人β-actin(Signal公司),兔抗人 CXCR4抗體,兔抗人E-cadherin及兔抗人Vimentin抗體(Santa Cruz公司),HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中衫金橋公司)。轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司),G418(Gibico公司)。PCR引物(于上海生工公司合成),real-time PCR試劑體系(TaKaRa公司)。質(zhì)粒載體PRNAT-U6.1/Neo-CXCR4-shRNA(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院王錚副教授饋贈(zèng))。

    1.2 Westen blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

    選擇生長良好的細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。SDSPAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光,膠片暗室顯影并掃描記錄分析。蛋白表達(dá)以吸光度表示,以目的蛋白/內(nèi)參蛋白β-actin表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.3 Real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄

    用Trizol-氯仿-異丙醇法提取各組細(xì)胞總RNA。取5 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增CXCR4,以GAPDH為內(nèi)參照。各目的基因引物序列如下:CXCR4:5'-CTGCG AGCAGAGGGTCCAG-3',5'-ATGAATGTCCACCTCGC TT-3';E-鈣黏附蛋白:5'-ATTCTGATTCTGCTGCTCT TG-3',5'-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3';波形蛋白:5'-AATGACCGCTTCGCCAAC-3',5'-CCGCATCTCCT CCTCGTAG-3';甘油醛-3-磷酸脫氫酶:5'-GTAAAG ACCTCTATGCCATCA-3',5'-GGACTCATCGTACTCC TGCT3-3'。實(shí)時(shí)定量PCR在Bio-Rad公司Real time PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 s,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán);溶解曲線條件:95℃ 15 s,60℃ 30 s,95℃ 15 s?;蛳鄬?duì)表達(dá)水平通過2ΔΔ法計(jì)算。

    1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化,用含10%胎牛血清無抗生素的PRIM-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×105/mL,以0.5 mL/孔于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜,約75%細(xì)胞匯合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞按1∶6接種于 6孔板,并加600 μg/mL G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選。14 d后出現(xiàn)多個(gè)G418抗性的集落,由于質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白GFP,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的陽性集落。顯微鏡下,用移液器槍頭吸取少量胰蛋白酶后挑取帶綠色熒光的單個(gè)集落。挑取的集落移入24孔培養(yǎng)板,G418維持培養(yǎng),經(jīng)過4周可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單集落的篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)后,鏡下可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞90%以上表達(dá)綠色熒光蛋白。

    1.5 肝癌細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞直接共培養(yǎng)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

    取生長良好的LX02細(xì)胞,消化后按5×104個(gè)細(xì)胞/mL的濃度500 μL接種24孔板內(nèi)。以預(yù)冷的RPMI-1640 與 Matrigel膠1∶1稀釋后,取100 μL稀釋膠加到Transwell上層小室中,于37℃孵育6 h。收集各組肝癌細(xì)胞,消化成單細(xì)胞懸液,用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,按5×104個(gè)/mL的濃度100 μL接種于Transwell上層小室。下室分別為含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液,含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液加100 ng/mL SDF-1,或2.5×104個(gè)LX02細(xì)胞。置于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽沾PBS輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長但未能穿過膜的細(xì)胞。將膜取出放入預(yù)先裝有95%乙醇的24孔板內(nèi)固定10 min。吸棄乙醇,加0.1%的結(jié)晶紫染色30 min,用PBS小心洗去多余的染料,翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜,小心撕下,晾干,置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大倍數(shù)下隨機(jī)觀察并計(jì)10個(gè)視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù),照相記錄。重復(fù)3次。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 SDF-1及配體CXCR4在肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

    肝星狀細(xì)胞LX02中有SDF-1蛋白強(qiáng)烈表達(dá)而其配體CXCR4蛋白不表達(dá);4株肝細(xì)胞癌細(xì)胞系均不表達(dá)或微弱表達(dá)SDF-1蛋白,但CXCR4蛋白均有較強(qiáng)程度的表達(dá)上調(diào),其中HepG2細(xì)胞表達(dá)水平最高(圖1A)。肝星狀細(xì)胞SDF-1 mRNA高表達(dá)而CXCR4 mRNA幾乎不表達(dá),相反4株肝細(xì)胞癌細(xì)胞系有不同程度的CXCR4表達(dá)上調(diào)而SDF-1均不表達(dá)或微弱表達(dá)(圖1B),檢測(cè)結(jié)果與Western blot相符。肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2和肝星狀細(xì)胞LX02中SDF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.002、2.421±0.467、1.740±0.073、2.882±0.605和30.079±2.011,4株肝癌細(xì)胞系與星狀細(xì)胞系具有顯著差異(P<0.05);CXCR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.797±0.214、2.130±0.210、1.033 ±0.058、5.216 ±0.642 和0.080±0.026,4株肝癌細(xì)胞系與星狀細(xì)胞系有顯著差異(P<0.05)。

    2.2 肝星狀細(xì)胞LX02促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲

    10%胎牛血清、10%胎牛血清+基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1和10%胎牛血清+LX02組HepG2細(xì)胞穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為49±16、171±22和155±13個(gè),組間差異顯著(P<0.05)。

    2.3 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT

    圖1 SDF-1及其唯一配體CXCR4在肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 The expressions of SDF-1 and its receptor CXCR4 in hepatic stellate cell and hepatocellular carcinoma cells

    圖2 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲Fig 2 Hepatic stellate cell LX02 induces hepatocellular carcinoma cell EMT and invasion(×400)

    加入外源性SDF-1干預(yù)或LX02細(xì)胞培養(yǎng)上清液間接共培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h,SDF-1干預(yù)和LX02共培養(yǎng)組的HepG2細(xì)胞的磷酸化ERK比正常對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.05)。較正常對(duì)照組,SDF-1干預(yù)和LX02共培養(yǎng)組E-cadherin蛋白明顯上調(diào)(P<0.05),vimentin蛋白顯著下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

    2.4 RNA干擾載體靶向沉默肝癌細(xì)胞HepG2 CXCR4表達(dá)

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)其侵襲是通SDF-1/CXCR4軸進(jìn)行的,構(gòu)建了靶向CXCR4沉默的HepG2細(xì)胞。干擾片段正義鏈:5'-GATCCGTGAGAAGCATGACGGACAATTCAAGAG ATTGTCCGTCATGCTTCTCATTTTTGGAAA-3',反 義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAAAATGAGAAGCATGACGGA CAATCTCTTGAATTGTCCGTCATGCTTCTCACG-3';作為對(duì)照的空載體上是負(fù)對(duì)照無關(guān)序列。經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后,對(duì)CXCR4沉默進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot結(jié)果及同時(shí)進(jìn)行的real-time PCR結(jié)果(圖3A,B)。

    2.5 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲依賴于SDF-1/CXCR4軸

    在Transwell小室10%胎牛血清、10%胎牛血清+基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1或10%胎牛血清+肝星狀細(xì)胞LX02趨化作用下,HepG2-Vector穿膜細(xì)胞數(shù)差異顯著(P<0.05);與此同時(shí),HepG2-CXCR4-穿膜細(xì)胞數(shù)無顯著差異(圖3C,D)。提取細(xì)胞總蛋白,經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果與提取細(xì)胞mRNA,經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3E,F(xiàn))。

    3 討論

    惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與腫瘤周圍的其他細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)、功能和代謝有關(guān)。在腫瘤微環(huán)境中,成纖維細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的主要成分,而在肝癌組織中,成纖維細(xì)胞的主要來源是肝星狀細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)活化的肝星狀細(xì)胞可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,而肝癌細(xì)胞又能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖,最終加速肝癌的進(jìn)程[6]。但肝癌細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞兩者之間的關(guān)系,特別是體內(nèi)相互作用及其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),星狀細(xì)胞能顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

    腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是啟動(dòng)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑之一,最終導(dǎo)致細(xì)胞活性和侵襲性增強(qiáng)[7]。EMT取決于局部腫瘤微環(huán)境與信號(hào)分子的作用,趨化因子SDF-1/CXCR4軸激活所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲的一個(gè)重要機(jī)制可能就是誘導(dǎo)了細(xì)胞EMT[8-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),肝星狀細(xì)胞和外源性SDF-1均可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的丟失和間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin的獲得,提示星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。

    Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞HepG2-Vector,在外源性SDF-1或星狀細(xì)胞LX02趨化下,均能誘導(dǎo)其侵襲增強(qiáng);而CXCR4干擾的細(xì)胞HepG2-CXCR4,無論是給予SDF-1或是星狀細(xì)胞LX02趨化,其遷移穿過小孔和穿透Matrigel膠的能力沒有明顯的變化。因此可以認(rèn)為,肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過程可能依賴于趨化因子SDF-1/CXCR4軸。

    圖3 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲依賴于SDF-1/CXCR4軸Fig 3 Hepatic stellate cell LX02 induces hepatocellular carcinoma cell EMT and invasion independing with SDF-1/CXCR4 axis

    通過Western blot和RT-PCR發(fā)現(xiàn),CXCR4沉默的細(xì)胞在外源性SDF-1或星狀細(xì)胞刺激下,其上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin沒有明顯變化;而對(duì)照組細(xì)胞E-cadherin下調(diào)vimentin上調(diào),顯示了肝癌細(xì)胞在星狀細(xì)胞刺激下發(fā)生EMT的過程。表明肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲可能與誘導(dǎo)其EMT轉(zhuǎn)化有關(guān)。

    綜上所述,本研究驗(yàn)證了肝星狀細(xì)胞通過趨化因子SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲和EMT,揭示了肝星狀細(xì)胞在肝癌進(jìn)程中的影響,為原發(fā)性肝癌發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制和治療研究提供新依據(jù),為原發(fā)性肝癌的預(yù)防、治療探索新靶點(diǎn)。

    [1]Yang JD,Nakamura I,Roberts LR.The tumor microenvironment in hepatocellular carcinoma:current status and therapeutic targets[J].Semin Cancer Biol,2011,21:35 -43.

    [2]Juarez J,Bendall L,Bradstock K.Chemokines and their receptors as therapeutic targets:the role of the SDF-1/CXCR4 axis[J].Curr Pharm Des,2004,10:1245 -1259.

    [3]Sun X,Cheng G,Hao M,et al.CXCL12/CXCR4/CXCR7 chemokine axis and cancer progression[J].Cancer Metastasis Rev,2010,29:709 -722.

    [4]施國英,施德金,呂偉標(biāo),等.基質(zhì)細(xì)胞衍化生長因子-1及其受體CXCR4在肝細(xì)胞癌和肝硬化中的表達(dá)[J].中華肝臟病雜志,2007,15:276-278.

    [5]Liu H,Pan Z,Li A,et al.Roles of chemokine receptor 4(CXCR4)and chemokine ligand 12(CXCL12)in metastasis of hepatocellular carcinoma cells[J].Cell Mol Immunol,2008,5:373 -378.

    [6]王偉,官陽,楊木蘭,等.活化肝星狀細(xì)胞與肝細(xì)胞肝癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移的相關(guān)性[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2007,492 -494.

    [7]Singh A,Settleman J.EMT,cancer stem cells and drug resistance:an emerging axis of evil in the war on cancer[J].Oncogene,2010,29:4741 -4751.

    [8]Mimeault M,Batra SK.Frequent gene products and molecular pathways altered in prostate cancer-and metastasis-initiating cells and their progenies and novel promising multitargeted therapies[J].Mol Med,2011,17:949 -964.

    [9]Li X,Ma Q,Xu Q,et al.SDF-1/CXCR4 signaling induces pancreatic cancer cell invasion and epithelial-mesenchymal transition in vitro through non-canonical activation of Hedgehog pathway[J].Cancer Lett,2012,322:169-176.

    猜你喜歡
    胎牛星狀小室
    細(xì)胞貼壁效應(yīng)是評(píng)價(jià)胎牛血清質(zhì)量的重要因素
    缺氧誘導(dǎo)因子-1α對(duì)肝星狀細(xì)胞影響的研究進(jìn)展
    The Six Swans (II)By Grimm Brothers
    2021年本刊一些常用詞匯可直接用縮寫(一)
    日媒勸“灰小子”早日放開公主
    日本公主的準(zhǔn)婆家靠譜嗎?
    暢談(2018年6期)2018-08-28 02:23:38
    Estimation of boundary-layer flow of a nanofluid past a stretching sheet: A revised model*
    新型寬帶橫電磁波小室的設(shè)計(jì)
    胎牛血清對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞HMEC-1體外成血管實(shí)驗(yàn)影響的觀察△
    超聲引導(dǎo)星狀神經(jīng)節(jié)阻滯治療原發(fā)性痛經(jīng)
    人人澡人人妻人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一夜夜www| 国产国语露脸激情在线看| 高清av免费在线| 一级毛片高清免费大全| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日本中文国产一区发布| 在线观看日韩欧美| 美女福利国产在线| 国产深夜福利视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 在线观看免费日韩欧美大片| xxx96com| 亚洲三区欧美一区| 99精品欧美一区二区三区四区| 母亲3免费完整高清在线观看| 成人国语在线视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 欧美色视频一区免费| 国产精品一区二区在线不卡| 热re99久久精品国产66热6| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 午夜成年电影在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 男女之事视频高清在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 无限看片的www在线观看| 老熟女久久久| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日本vs欧美在线观看视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人三级做爰电影| av电影中文网址| 自线自在国产av| 99热只有精品国产| 91国产中文字幕| 制服人妻中文乱码| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利欧美成人| 人成视频在线观看免费观看| 国产精品 欧美亚洲| 国产精品国产高清国产av | av一本久久久久| 欧美性长视频在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| a级毛片在线看网站| 久久草成人影院| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美日韩精品网址| 欧美+亚洲+日韩+国产| 啦啦啦 在线观看视频| 久久香蕉激情| 99国产精品99久久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 咕卡用的链子| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 狂野欧美激情性xxxx| 一本综合久久免费| 亚洲国产看品久久| 国产成人影院久久av| 在线播放国产精品三级| 动漫黄色视频在线观看| 久久久国产精品麻豆| bbb黄色大片| 国产1区2区3区精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成年人免费黄色播放视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 热re99久久国产66热| 自线自在国产av| 老司机影院毛片| 免费不卡黄色视频| 下体分泌物呈黄色| 免费在线观看完整版高清| 久久精品亚洲av国产电影网| 热re99久久国产66热| av天堂在线播放| 大陆偷拍与自拍| 亚洲免费av在线视频| 亚洲专区字幕在线| 两个人免费观看高清视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 高清在线国产一区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人亚洲精品一区在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 757午夜福利合集在线观看| 国产不卡一卡二| 最近最新免费中文字幕在线| 99精品在免费线老司机午夜| 一级a爱片免费观看的视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲成人免费电影在线观看| 午夜福利免费观看在线| 欧美黄色淫秽网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 日韩欧美三级三区| 亚洲欧美激情综合另类| 国产乱人伦免费视频| 国产精品国产av在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜精品国产一区二区电影| 男女之事视频高清在线观看| 国产片内射在线| 黄色成人免费大全| 成人免费观看视频高清| 亚洲人成电影免费在线| 久久久久久久久免费视频了| 下体分泌物呈黄色| 国产精品久久久av美女十八| 国产男女超爽视频在线观看| 在线观看日韩欧美| 淫妇啪啪啪对白视频| 韩国av一区二区三区四区| 一级a爱视频在线免费观看| 免费在线观看影片大全网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美日韩福利视频一区二区| 91老司机精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| av欧美777| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩欧美免费精品| 在线观看日韩欧美| 亚洲情色 制服丝袜| 咕卡用的链子| 丝瓜视频免费看黄片| 两个人免费观看高清视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲精品自拍成人| 午夜成年电影在线免费观看| 不卡av一区二区三区| 丝袜在线中文字幕| 国产精品二区激情视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利在线观看吧| 久久久久久久久免费视频了| 天堂√8在线中文| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 制服诱惑二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线观看一区二区三区激情| 99riav亚洲国产免费| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 男女之事视频高清在线观看| 精品少妇久久久久久888优播| 午夜免费成人在线视频| 超色免费av| 窝窝影院91人妻| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美在线一区亚洲| 亚洲色图综合在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 嫁个100分男人电影在线观看| 日日夜夜操网爽| 免费看a级黄色片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产成人精品久久二区二区免费| 成年动漫av网址| 桃红色精品国产亚洲av| 久久精品国产综合久久久| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 十八禁人妻一区二区| 一区二区三区国产精品乱码| 久热这里只有精品99| 两性夫妻黄色片| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品一二三| 视频区图区小说| 亚洲一区中文字幕在线| 国产真人三级小视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| 制服诱惑二区| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲成人手机| 飞空精品影院首页| 丰满的人妻完整版| 性色av乱码一区二区三区2| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | av中文乱码字幕在线| 黄片小视频在线播放| 在线观看午夜福利视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 老司机在亚洲福利影院| 国产在线观看jvid| 18禁美女被吸乳视频| 大码成人一级视频| 99国产精品一区二区三区| 国产野战对白在线观看| 天天添夜夜摸| 三级毛片av免费| 99热只有精品国产| 最近最新免费中文字幕在线| 大片电影免费在线观看免费| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜福利视频在线观看免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久久久久久国产电影| 宅男免费午夜| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 看黄色毛片网站| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 人妻 亚洲 视频| 午夜精品在线福利| 色综合婷婷激情| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日韩中文字幕欧美一区二区| 人人妻人人澡人人看| 久久久国产成人免费| 午夜视频精品福利| 999久久久国产精品视频| 精品人妻1区二区| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品二区激情视频| 亚洲中文av在线| 国产欧美亚洲国产| 久久香蕉国产精品| 亚洲性夜色夜夜综合| 性色av乱码一区二区三区2| 国产97色在线日韩免费| 9191精品国产免费久久| 午夜福利视频在线观看免费| 电影成人av| 午夜成年电影在线免费观看| 老司机深夜福利视频在线观看| tube8黄色片| 天堂中文最新版在线下载| 日本欧美视频一区| 欧美激情高清一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 在线观看一区二区三区激情| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 99久久综合精品五月天人人| 国产精品99久久99久久久不卡| 精品人妻在线不人妻| 欧美精品亚洲一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 色婷婷av一区二区三区视频| 成人永久免费在线观看视频| 搡老岳熟女国产| 90打野战视频偷拍视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 成人精品一区二区免费| 久久久久久久国产电影| 午夜福利免费观看在线| x7x7x7水蜜桃| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 婷婷丁香在线五月| 无遮挡黄片免费观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲av成人一区二区三| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产精品免费视频内射| 亚洲av日韩在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 91精品三级在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产三级黄色录像| 夜夜夜夜夜久久久久| 美女国产高潮福利片在线看| av视频免费观看在线观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 热99国产精品久久久久久7| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲九九香蕉| 美女扒开内裤让男人捅视频| 麻豆成人av在线观看| 国产精品二区激情视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲片人在线观看| 欧美乱妇无乱码| netflix在线观看网站| 麻豆成人av在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 免费在线观看亚洲国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 在线天堂中文资源库| aaaaa片日本免费| av免费在线观看网站| 黄片小视频在线播放| 男人操女人黄网站| 亚洲av片天天在线观看| 国产不卡一卡二| 国产精华一区二区三区| 热re99久久国产66热| 精品久久久久久,| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91老司机精品| av天堂在线播放| 日韩欧美免费精品| av天堂久久9| 少妇粗大呻吟视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 青草久久国产| 国产激情欧美一区二区| 午夜免费成人在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 美女福利国产在线| 色在线成人网| 国产欧美亚洲国产| 成人国语在线视频| 亚洲熟女毛片儿| 岛国毛片在线播放| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 又黄又爽又免费观看的视频| 在线观看免费视频网站a站| 久久九九热精品免费| 国产成人精品久久二区二区免费| 美女午夜性视频免费| 欧美乱妇无乱码| 欧美乱码精品一区二区三区| 丁香欧美五月| 国产成人影院久久av| 91精品国产国语对白视频| 韩国精品一区二区三区| 18禁美女被吸乳视频| 高清在线国产一区| 亚洲精品国产区一区二| 在线天堂中文资源库| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看www视频免费| 久久中文字幕一级| 最新美女视频免费是黄的| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品久久视频播放| 国产成人免费无遮挡视频| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕精品免费在线观看视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 国产精品1区2区在线观看. | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费观看精品视频网站| 自线自在国产av| 精品免费久久久久久久清纯 | 另类亚洲欧美激情| 国产国语露脸激情在线看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜免费鲁丝| 美女午夜性视频免费| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| www日本在线高清视频| 丁香六月欧美| 午夜福利欧美成人| 日本一区二区免费在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲av电影在线进入| xxx96com| 男女午夜视频在线观看| 超色免费av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产精品影院久久| 一级,二级,三级黄色视频| xxxhd国产人妻xxx| 成人三级做爰电影| 欧美 日韩 精品 国产| 久久久久久久久久久久大奶| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久天堂一区二区三区四区| 日韩欧美在线二视频 | 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 少妇粗大呻吟视频| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美av亚洲av综合av国产av| 制服诱惑二区| 女同久久另类99精品国产91| 欧美激情高清一区二区三区| 精品第一国产精品| 午夜福利视频在线观看免费| 国产色视频综合| 国产精品久久久久成人av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 午夜视频精品福利| 男女下面插进去视频免费观看| 午夜免费鲁丝| 精品一区二区三卡| 精品无人区乱码1区二区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品在线美女| 久久亚洲真实| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 99在线人妻在线中文字幕 | 十八禁高潮呻吟视频| 精品福利永久在线观看| 不卡av一区二区三区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲精品在线美女| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人免费av在线播放| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜福利,免费看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产av一区二区精品久久| 久久草成人影院| 十八禁高潮呻吟视频| 成人手机av| 国产免费男女视频| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 午夜影院日韩av| 99香蕉大伊视频| 麻豆成人av在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 99国产精品免费福利视频| 国产精品久久电影中文字幕 | 大型av网站在线播放| 美国免费a级毛片| www.999成人在线观看| 成人影院久久| 天天影视国产精品| 操出白浆在线播放| 久热爱精品视频在线9| 午夜亚洲福利在线播放| 制服人妻中文乱码| videos熟女内射| 无人区码免费观看不卡| 激情视频va一区二区三区| 国产精品 国内视频| av不卡在线播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品国内亚洲2022精品成人 | 青草久久国产| 国产精品98久久久久久宅男小说| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品国产美女av久久久久小说| 一级片'在线观看视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 一进一出抽搐动态| 飞空精品影院首页| 国产色视频综合| 在线观看66精品国产| 啪啪无遮挡十八禁网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 黑丝袜美女国产一区| 日日夜夜操网爽| 99国产精品免费福利视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 欧美成人免费av一区二区三区 | 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲 欧美一区二区三区| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品欧美亚洲77777| 日本欧美视频一区| 99热网站在线观看| av线在线观看网站| 亚洲人成电影免费在线| 丝袜在线中文字幕| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久国内视频| 九色亚洲精品在线播放| 在线看a的网站| 亚洲专区字幕在线| 村上凉子中文字幕在线| 在线观看日韩欧美| 中文字幕制服av| 亚洲熟女精品中文字幕| 午夜两性在线视频| 母亲3免费完整高清在线观看| av电影中文网址| 露出奶头的视频| 一级毛片高清免费大全| 欧美日本中文国产一区发布| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 在线观看免费日韩欧美大片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲精品在线美女| 两性夫妻黄色片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 久久九九热精品免费| 国产一区二区三区视频了| 亚洲熟女精品中文字幕| 飞空精品影院首页| 在线观看免费午夜福利视频| www.自偷自拍.com| 免费在线观看亚洲国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品久久久久久电影网| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| bbb黄色大片| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 波多野结衣av一区二区av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩av久久| 久久国产精品大桥未久av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色老头精品视频在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 精品福利观看| 国产成人影院久久av| 热re99久久精品国产66热6| 久9热在线精品视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日本vs欧美在线观看视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲avbb在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 国产午夜精品久久久久久| 真人做人爱边吃奶动态| 俄罗斯特黄特色一大片| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲精品自拍成人| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产成人av教育| 91成人精品电影| 成熟少妇高潮喷水视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 91老司机精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲欧美激情在线| 欧美日韩视频精品一区| 成人av一区二区三区在线看| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲av日韩在线播放| 午夜福利影视在线免费观看| 久久久水蜜桃国产精品网| 看黄色毛片网站| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲五月色婷婷综合| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 久9热在线精品视频| 精品亚洲成国产av| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 高清毛片免费观看视频网站 | 水蜜桃什么品种好| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品亚洲一级av第二区| 热99re8久久精品国产| 国产男靠女视频免费网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久天堂一区二区三区四区| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲精品乱久久久久久| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 露出奶头的视频| 下体分泌物呈黄色| 亚洲五月婷婷丁香| 久久精品国产a三级三级三级| 多毛熟女@视频| 天堂动漫精品| 国产1区2区3区精品| 香蕉丝袜av| 曰老女人黄片| 男人的好看免费观看在线视频 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产看品久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 成人免费观看视频高清| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 精品国产乱码久久久久久男人| 女性被躁到高潮视频| 香蕉国产在线看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 性少妇av在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看 |