肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化并促進(jìn)其侵襲

李四光，常遠(yuǎn)鴻，劉凱歌

(1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西西安710021;2.西安市第四醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安710004;3.西安醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西西安710077)

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟正?；虿±頎顟B(tài)下細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，有實(shí)驗(yàn)表明肝癌腫瘤微環(huán)境中的肝星狀細(xì)胞可能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移［1］。

SDF-1(stromal cell derived factor-1，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)是Cys-X-Cys類趨化蛋白，在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、歸巢等方面有多重作用。細(xì)胞趨化因子受體CXCR4是SDF-1的特異性受體，相互為一配一的唯一性配體/受體關(guān)系［2］。SDF-1結(jié)合激活CXCR4后使細(xì)胞肌動(dòng)蛋白絲聚合，形成假偽足，定向遷移侵襲。許多惡性腫瘤中均有CXCR4異常表達(dá)［3］。有研究揭示，CXCR4在肝癌組織中異常高表達(dá)，且與預(yù)后明確相關(guān)［4］;而活化的肝星狀細(xì)胞是SDF-1的主要來源［5］。本研究擬通過肝星狀細(xì)胞與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，進(jìn)一步研究肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2和人肝星狀細(xì)胞系LX02由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。四甲基偶氮唑鹽(MTT)/二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)。聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，Transwell小室(Milliproe公司)。鼠抗人p-REK、鼠抗人t-ERK抗體及鼠抗人β-actin(Signal公司)，兔抗人 CXCR4抗體，兔抗人E-cadherin及兔抗人Vimentin抗體(Santa Cruz公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(北京中衫金橋公司)。轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)，G418(Gibico公司)。PCR引物(于上海生工公司合成)，real-time PCR試劑體系(TaKaRa公司)。質(zhì)粒載體PRNAT-U6.1/Neo-CXCR4-shRNA(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院王錚副教授饋贈(zèng))。

1.2 Westen blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

選擇生長良好的細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。SDSPAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，膠片暗室顯影并掃描記錄分析。蛋白表達(dá)以吸光度表示，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白β-actin表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 Real-time RT-PCR檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄

用Trizol-氯仿-異丙醇法提取各組細(xì)胞總RNA。取5 μg按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以cDNA為模板PCR擴(kuò)增CXCR4，以GAPDH為內(nèi)參照。各目的基因引物序列如下:CXCR4:5'-CTGCG AGCAGAGGGTCCAG-3'，5'-ATGAATGTCCACCTCGC TT-3';E-鈣黏附蛋白:5'-ATTCTGATTCTGCTGCTCT TG-3'，5'-AGTCCTGGTCCTCTTCTCC-3';波形蛋白:5'-AATGACCGCTTCGCCAAC-3'，5'-CCGCATCTCCT CCTCGTAG-3';甘油醛-3-磷酸脫氫酶:5'-GTAAAG ACCTCTATGCCATCA-3'，5'-GGACTCATCGTACTCC TGCT3-3'。實(shí)時(shí)定量PCR在Bio-Rad公司Real time PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5 s，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共40個(gè)循環(huán);溶解曲線條件:95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s?；蛳鄬?duì)表達(dá)水平通過2ΔΔ法計(jì)算。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化，用含10%胎牛血清無抗生素的PRIM-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×105/mL，以0.5 mL/孔于24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜，約75%細(xì)胞匯合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞按1∶6接種于 6孔板，并加600 μg/mL G418進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染篩選。14 d后出現(xiàn)多個(gè)G418抗性的集落，由于質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白GFP，在熒光顯微鏡下可見綠色熒光的陽性集落。顯微鏡下，用移液器槍頭吸取少量胰蛋白酶后挑取帶綠色熒光的單個(gè)集落。挑取的集落移入24孔培養(yǎng)板，G418維持培養(yǎng)，經(jīng)過4周可以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞集落。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單集落的篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)后，鏡下可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞90%以上表達(dá)綠色熒光蛋白。

1.5 肝癌細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞直接共培養(yǎng)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)

取生長良好的LX02細(xì)胞，消化后按5×104個(gè)細(xì)胞/mL的濃度500 μL接種24孔板內(nèi)。以預(yù)冷的RPMI-1640 與 Matrigel膠1∶1稀釋后，取100 μL稀釋膠加到Transwell上層小室中，于37℃孵育6 h。收集各組肝癌細(xì)胞，消化成單細(xì)胞懸液，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，按5×104個(gè)/mL的濃度100 μL接種于Transwell上層小室。下室分別為含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液，含10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液加100 ng/mL SDF-1，或2.5×104個(gè)LX02細(xì)胞。置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用棉簽沾PBS輕輕地擦去小室上層聚碳酸酯膜上貼壁生長但未能穿過膜的細(xì)胞。將膜取出放入預(yù)先裝有95%乙醇的24孔板內(nèi)固定10 min。吸棄乙醇，加0.1%的結(jié)晶紫染色30 min，用PBS小心洗去多余的染料，翻轉(zhuǎn)聚碳酸酯膜，小心撕下，晾干，置載玻片上加中性樹膠蓋玻片封片。在200倍放大倍數(shù)下隨機(jī)觀察并計(jì)10個(gè)視野內(nèi)穿過聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)，照相記錄。重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SDF-1及配體CXCR4在肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)

肝星狀細(xì)胞LX02中有SDF-1蛋白強(qiáng)烈表達(dá)而其配體CXCR4蛋白不表達(dá);4株肝細(xì)胞癌細(xì)胞系均不表達(dá)或微弱表達(dá)SDF-1蛋白，但CXCR4蛋白均有較強(qiáng)程度的表達(dá)上調(diào)，其中HepG2細(xì)胞表達(dá)水平最高(圖1A)。肝星狀細(xì)胞SDF-1 mRNA高表達(dá)而CXCR4 mRNA幾乎不表達(dá)，相反4株肝細(xì)胞癌細(xì)胞系有不同程度的CXCR4表達(dá)上調(diào)而SDF-1均不表達(dá)或微弱表達(dá)(圖1B)，檢測(cè)結(jié)果與Western blot相符。肝細(xì)胞癌細(xì)胞系 MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2和肝星狀細(xì)胞LX02中SDF-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.002、2.421±0.467、1.740±0.073、2.882±0.605和30.079±2.011，4株肝癌細(xì)胞系與星狀細(xì)胞系具有顯著差異(P＜0.05);CXCR4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.797±0.214、2.130±0.210、1.033 ±0.058、5.216 ±0.642 和0.080±0.026，4株肝癌細(xì)胞系與星狀細(xì)胞系有顯著差異(P＜0.05)。

2.2 肝星狀細(xì)胞LX02促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲

10%胎牛血清、10%胎牛血清+基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1和10%胎牛血清+LX02組HepG2細(xì)胞穿過Transwell小室的細(xì)胞數(shù)分別為49±16、171±22和155±13個(gè)，組間差異顯著(P＜0.05)。

2.3 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT

圖1 SDF-1及其唯一配體CXCR4在肝星狀細(xì)胞和肝癌細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 The expressions of SDF-1 and its receptor CXCR4 in hepatic stellate cell and hepatocellular carcinoma cells

圖2 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲Fig 2 Hepatic stellate cell LX02 induces hepatocellular carcinoma cell EMT and invasion(×400)

加入外源性SDF-1干預(yù)或LX02細(xì)胞培養(yǎng)上清液間接共培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h，SDF-1干預(yù)和LX02共培養(yǎng)組的HepG2細(xì)胞的磷酸化ERK比正常對(duì)照組顯著上調(diào)(P＜0.05)。較正常對(duì)照組，SDF-1干預(yù)和LX02共培養(yǎng)組E-cadherin蛋白明顯上調(diào)(P＜0.05)，vimentin蛋白顯著下調(diào)(P＜0.05)(圖2)。

2.4 RNA干擾載體靶向沉默肝癌細(xì)胞HepG2 CXCR4表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)其侵襲是通SDF-1/CXCR4軸進(jìn)行的，構(gòu)建了靶向CXCR4沉默的HepG2細(xì)胞。干擾片段正義鏈:5'-GATCCGTGAGAAGCATGACGGACAATTCAAGAG ATTGTCCGTCATGCTTCTCATTTTTGGAAA-3'，反 義鏈:5'-AGCTTTTCCAAAAAATGAGAAGCATGACGGA CAATCTCTTGAATTGTCCGTCATGCTTCTCACG-3';作為對(duì)照的空載體上是負(fù)對(duì)照無關(guān)序列。經(jīng)G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系后，對(duì)CXCR4沉默進(jìn)行驗(yàn)證。Western blot結(jié)果及同時(shí)進(jìn)行的real-time PCR結(jié)果(圖3A，B)。

2.5 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲依賴于SDF-1/CXCR4軸

在Transwell小室10%胎牛血清、10%胎牛血清+基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1或10%胎牛血清+肝星狀細(xì)胞LX02趨化作用下，HepG2-Vector穿膜細(xì)胞數(shù)差異顯著(P＜0.05);與此同時(shí)，HepG2-CXCR4-穿膜細(xì)胞數(shù)無顯著差異(圖3C，D)。提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blot檢測(cè)結(jié)果與提取細(xì)胞mRNA，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖3E，F(xiàn))。

3 討論

惡性腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與腫瘤周圍的其他細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)、功能和代謝有關(guān)。在腫瘤微環(huán)境中，成纖維細(xì)胞是腫瘤間質(zhì)的主要成分，而在肝癌組織中，成纖維細(xì)胞的主要來源是肝星狀細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)活化的肝星狀細(xì)胞可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，而肝癌細(xì)胞又能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖，最終加速肝癌的進(jìn)程［6］。但肝癌細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞兩者之間的關(guān)系，特別是體內(nèi)相互作用及其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究通過Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，星狀細(xì)胞能顯著增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

腫瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是啟動(dòng)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，最終導(dǎo)致細(xì)胞活性和侵襲性增強(qiáng)［7］。EMT取決于局部腫瘤微環(huán)境與信號(hào)分子的作用，趨化因子SDF-1/CXCR4軸激活所誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞侵襲的一個(gè)重要機(jī)制可能就是誘導(dǎo)了細(xì)胞EMT［8－9］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞和外源性SDF-1均可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin的丟失和間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin的獲得，提示星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制可能與誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞HepG2-Vector，在外源性SDF-1或星狀細(xì)胞LX02趨化下，均能誘導(dǎo)其侵襲增強(qiáng);而CXCR4干擾的細(xì)胞HepG2-CXCR4，無論是給予SDF-1或是星狀細(xì)胞LX02趨化，其遷移穿過小孔和穿透Matrigel膠的能力沒有明顯的變化。因此可以認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲的過程可能依賴于趨化因子SDF-1/CXCR4軸。

圖3 肝星狀細(xì)胞LX02誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞EMT并促進(jìn)侵襲依賴于SDF-1/CXCR4軸Fig 3 Hepatic stellate cell LX02 induces hepatocellular carcinoma cell EMT and invasion independing with SDF-1/CXCR4 axis

通過Western blot和RT-PCR發(fā)現(xiàn)，CXCR4沉默的細(xì)胞在外源性SDF-1或星狀細(xì)胞刺激下，其上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin和間質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin沒有明顯變化;而對(duì)照組細(xì)胞E-cadherin下調(diào)vimentin上調(diào)，顯示了肝癌細(xì)胞在星狀細(xì)胞刺激下發(fā)生EMT的過程。表明肝星狀細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4軸促進(jìn)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲可能與誘導(dǎo)其EMT轉(zhuǎn)化有關(guān)。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了肝星狀細(xì)胞通過趨化因子SDF-1/CXCR4軸誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞侵襲和EMT，揭示了肝星狀細(xì)胞在肝癌進(jìn)程中的影響，為原發(fā)性肝癌發(fā)展轉(zhuǎn)移機(jī)制和治療研究提供新依據(jù)，為原發(fā)性肝癌的預(yù)防、治療探索新靶點(diǎn)。

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