骨形態(tài)發(fā)生蛋白4通過(guò)ERK/MAPK信號(hào)通路影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的成血管能力

王 琴，仉紅剛，卡米拉·阿不里米提，張秋菊，修瑞娟

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院微循環(huán)研究所，北京100005)

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族中的一類(lèi)成員，它們對(duì)于細(xì)胞的分化、增殖、遷移、存活等生物學(xué)過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用［1－2］。最初的研究認(rèn)為，BMP-2和BMP-4在間質(zhì)干細(xì)胞的分化以及骨及軟骨的形成及修復(fù)過(guò)程中骨的形成和血管的形成具有重要作用［3－4］。然而，也有不少的研究結(jié)果顯示，BMPs及其受體參與血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)。例如，BMP-4表達(dá)缺陷的小鼠，其心臟及脈管系統(tǒng)的發(fā)育異常［5］，敲除了Smad1或Smad5基因的小鼠由于脈管系統(tǒng)發(fā)育不完全而死于胚胎期［6］。另外，BMPs影響小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞及人表皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［7］。盡管BMPs對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞功能的作用越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注，但是，BMPs，特別是BMP-4對(duì)于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞成血管能力的影響及其作用機(jī)制的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。故本研究主要分析了BMP-4對(duì)于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，遷移，體外成血管能力的影響，并且對(duì)于參與其中的分子機(jī)制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 試劑

無(wú)菌PBS，D'Hanks(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)，Hanks，BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Invitrogen公司)，膠原酶Ⅳ，纖維連接蛋白(Sigma公司)，內(nèi)皮細(xì)胞用培養(yǎng)基(Sciencell公司)，細(xì)胞因子BMP-4(R＆D Systems公司)，包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠(Miltenyi公司);小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗(Santa Cruz公司);基質(zhì)膠(BD Biosciences公司)，RIPA裂解液，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天公司)，BCA定量試劑盒(普利萊公司);兔源抗 phospho ERK1/2一抗，兔源抗 total ERK1/2一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔二抗(Cell Signaling公司)。

1.2 HUVEC的分離與培養(yǎng)

原代分離HUVECs，步驟參照文獻(xiàn)［8］。采用含10%FBS的內(nèi)皮細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2的孵箱中，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 HUVECs的純化與鑒定

使用包被小鼠抗人CD31單克隆抗體的免疫磁珠對(duì)原代分離的HUVECs進(jìn)一步純化。以小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體及TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠熒光二抗鑒定純化后的HUVECs。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

細(xì)胞增殖的檢測(cè)采用BrdU法，利用BrdU試劑盒進(jìn)行，步驟如下:按照5×103個(gè)/孔的接種密度將HUVEC接種至96孔板。血清饑餓8 h。分別以不同濃度的 BMP-4(5、10、20、50 和100 ng/mL)處理細(xì)胞24 h，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔。在BMP-4作用細(xì)胞8 h后，加入BrdU，BMP-4作用24 h后，將細(xì)胞固定。加入抗BrdU的一抗，室溫，1 h。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫，30 min。加入辣根過(guò)氧化物酶底物，室溫，避光，30 min。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)用于觀察BMP-4對(duì)HUVECs遷移能力的影響。步驟如下:采用包被纖維連接蛋白(10 mg/L)的12孔板培養(yǎng)HUVECs至匯合。使用200 μL黃色槍頭垂直于細(xì)胞培養(yǎng)面劃出相互垂直的兩條直線。PBS洗2次，倒置顯微鏡下以?xún)蓷l劃痕的交點(diǎn)為中心，在5×物鏡下對(duì)連續(xù)5個(gè)視野進(jìn)行拍照記錄;干預(yù)細(xì)胞:在干預(yù)前8 h以無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理后，進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)照組:以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h;BMP-4組:分別以濃度為5、10、20、50 和100 ng/mL的 BMP-4 作用細(xì)胞24 h;結(jié)晶紫染色HUVECs并在同一位置拍照記錄遷移情況;使用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定單個(gè)視野十字劃痕內(nèi)的細(xì)胞數(shù)以衡量HUVECs的遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 HUVEC體外成血管能力檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)考察BMP-4干預(yù)下HUVECs形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)的能力。步驟如下:實(shí)驗(yàn)前1 d應(yīng)把96孔板，200 μL黃色槍頭移至4℃遇冷過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)前1 d將基質(zhì)膠自－20℃移至4℃過(guò)夜緩慢融化;在冰上以每孔25 μL基質(zhì)膠包被96孔板;37℃ 30 min使膠凝固;每孔接種5×103個(gè)HUVECs，培養(yǎng)基最終體積為100 μL，24 h后觀察各組成管情況，以 HUVECs是否形成血管管腔樣結(jié)構(gòu)衡量其成管能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot

細(xì)胞長(zhǎng)至匯合后，分別以上述濃度的BMP-4處理細(xì)胞10 min，RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每孔上樣量為30 μg。電泳，恒壓65 V，約40 min時(shí)樣品前沿進(jìn)入分離膠，切換電壓到120 V，直至溴酚藍(lán)跑到距膠底沿1.0 cm時(shí)終止電泳。采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流，86 mA，3 h。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察

HUVECs呈單層貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞為扁平短梭狀。待細(xì)胞匯合后即表現(xiàn)為鵝卵石樣(圖1A)。免疫熒光染色顯示細(xì)胞為VE-cadherin陽(yáng)性，證實(shí)細(xì)胞確為HUVECs(圖1B)。

2.2 BMP-4對(duì)HUVEC增殖能力的影響

與對(duì)照組相比，只有在BMP-4濃度是20 ng/mL時(shí)，對(duì)HUVEC的增殖才有顯著抑制作用。當(dāng)BMP-4的濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的增殖能力又恢復(fù)到正常水平(圖2)。

2.3 BMP-4對(duì)HUVEC遷移的影響

與對(duì)照組相比，只在BMP4濃度是20 ng/mL時(shí)，對(duì)HUVEC的遷移才有顯著抑制作用。當(dāng)BMP-4濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的遷移能力又恢復(fù)到正常水平(圖3)。

2.4 BMP-4對(duì)HUVEC體外成血管能力的影響

圖1 HUVECs的形態(tài)學(xué)觀察Fig 1 Morphology of HUVECs(×400)

與對(duì)照組相比，只在 BMP-4濃度是20 ng/mL時(shí)，對(duì)HUVEC的體外成血管能力才有顯著抑制作用。當(dāng)BMP-4濃度為50和100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC的體外成血管能力又恢復(fù)到正常水平(圖4)。

2.5 ERK/MAPK信號(hào)通路參與BMP-4對(duì)HUVEC成血管能力的影響

與對(duì)照組相比，BMP-4在低濃度即 5，10，20 ng/mL時(shí)抑制HUVEC ERK/MAPK的活性，但是這種抑制作用只在 BMP4濃度是10 ng/mL與20 ng/mL時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，隨著B(niǎo)MP-4濃度的繼續(xù)升高，即BMP-4的濃度為50，100 ng/mL，這種抑制作用減弱，HUVEC ERK/MAPK活性又恢復(fù)到正常水平(圖5)。

3 討論

早期的文獻(xiàn)表明，BMPs在胚胎早期發(fā)育和血管系統(tǒng)的形成過(guò)程中具有重要的作用，之后，陸續(xù)有研究關(guān)注BMPs對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管能力的影響［9］。然而，針對(duì)BMP-4對(duì)于臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外成血管能力的影響的研究至今仍很少見(jiàn)。本研究結(jié)果表明，BMP-4的濃度在20 ng/mL時(shí)，才對(duì)HUVECs的成血管能力有顯著抑制作用。然而，當(dāng)BMP-4的濃度升高至50和100 ng/mL時(shí)，這種抑制作用逐漸減弱，并有恢復(fù)到正常水平的跡象，這一結(jié)果與一些研究結(jié)果存在一定的不一致，如BMP-2呈濃度依賴(lài)型促進(jìn)HUVEC的增殖。遷移［10］，盡管BMP-2和BMP-4屬于BMPs家族中同一亞類(lèi)，但是這種不一致仍然可能與BMP-2和BMP-4的生物學(xué)功能存在一定的差異有關(guān)。

圖2 BMP-4對(duì)HUVEC增殖能力的影響Fig 2 Effects of BMP-4 at different concertrations on HUVEC proliferation

BMPs與受體結(jié)合后，Ⅰ型受體被組成型活化的Ⅱ型受體磷酸化，繼而啟動(dòng)Smad信號(hào)級(jí)聯(lián)通路。Smad1/Smad5/Smad8被活化的Ⅰ型受體磷酸化后，與co-Smad(Smad4)結(jié)合后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核以調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。然而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，存在不同于Smad通路以外的其他信號(hào)通路參與 BMP-4對(duì)HUVEC成血管能力，即ERK/MAPK通路，這一結(jié)果與一些研究結(jié)果一致，認(rèn)為 BMPs通過(guò) ERK/MAPK［11－12］通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化和凋亡。

圖5 BMP-4對(duì)HUVEC ERK1/2的影響Fig 5 Effects of BMP-4 on pERK1/2 expression of HUVECs(±s)

本研究結(jié)果顯示，BMP-4在低濃度時(shí)具有抑制HUVEC的增殖、遷移和成血管，然而隨著B(niǎo)MP-4濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱，phospho ERK1/2水平的變化趨勢(shì)與上述作用一致，故本研究結(jié)果提示BMP-4對(duì)于HUVEC體外成血管能力的影響可能是通過(guò)ERK/MAPK發(fā)揮作用的。此外，有研究認(rèn)為，BMP-4通過(guò) dual-specificity phosphatase(DUSP)的磷酸酶來(lái)調(diào)節(jié)phospho ERK1/2的水平［13］。在本研究中，BMP-4 對(duì)于phospho ERK1/2水平的調(diào)控是否也是通過(guò)DUSP家族成員進(jìn)行的有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，BMP-4在低濃度時(shí)具有抑制HUVEC的增殖、遷移和成血管，然而隨著B(niǎo)MP-4濃度的升高，這種抑制作用逐漸減弱，并有恢復(fù)至正常水平的趨勢(shì)，BMP-4對(duì)于HUVEC體外成血管能力的影響可能是通過(guò)ERK/MAPK發(fā)揮作用的。

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