高濃度葡萄糖通過(guò)下調(diào)自噬增加體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的凋亡

屈 嶺，顧 蓓，張 宏，石 玥，梁曉春*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科，北京100730;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，北京100005)

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。自噬是機(jī)體處于物質(zhì)與能量代謝障礙時(shí)由細(xì)胞初級(jí)溶酶體處理內(nèi)容性底物的重要生理過(guò)程［1］。已有文獻(xiàn)報(bào)道其在保護(hù)胰島β細(xì)胞、改善胰島素抵抗以及延緩糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的作用［2］。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖可減少INS-1β細(xì)胞的自噬［3］。前期研究曾經(jīng)證實(shí)高糖可下調(diào)體外原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的增殖活性，并能上調(diào)活化的半胱氨酸天冬氨酸酶3(cysteine aspartase-3，caspase-3)的蛋白表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平［4－5］。自噬是否在高糖致體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的損傷中也具有作用呢?為此本研究以永生化的大鼠雪旺細(xì)胞(RSC96)作為模型，觀察了高濃度葡萄糖對(duì)RSC96細(xì)胞自噬的影響以及自噬對(duì)高糖條件下RSC96細(xì)胞增殖活性及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RSC96細(xì)胞(一種永生化的大鼠雪旺細(xì)胞)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、0.05%胰蛋白酶(Hyclone公司)，丙酮酸鈉、谷氨酰胺、G-418、MTT、3-MA(Sigma 公司)，兔抗大鼠Beclin1多克隆抗體(Abcam公司)，兔抗大鼠caspase-3多克隆抗體(Santa Cruz公司)，小鼠抗大鼠S-100單克隆抗體(博士德公司)，TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 RSC96細(xì)胞培養(yǎng)及培養(yǎng)條件

復(fù)蘇RSC96細(xì)胞，加入DMEM培養(yǎng)基、FBS(終濃度20%)、谷氨酰胺(終濃度2 mmol/L)、丙酮酸鈉(終濃度1 mmol/L)、HEPES(終濃度12.5 mmol/L)、PS(終濃度青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)，2～3 d換液1次。正常對(duì)照(Con)組為DMEM培養(yǎng)基;高濃度葡萄糖(Glu)為DMEM培養(yǎng)基+葡萄糖(終濃度125 mmol/L)。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)濃度10 mmol/L。

1.3 MTT比色法

取96孔板，棄培養(yǎng)基，加入10%MTT 200 μL/孔于37℃孵育2～4 h后，吸出培養(yǎng)液，加入 DMSO 200 μL/孔，室溫靜置30 min至1 h于酶標(biāo)分析儀檢測(cè)吸光度值(absorbance，A)，檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。重復(fù)5孔。

1.4 Western blot

各組細(xì)胞標(biāo)本加入裂解液進(jìn)行勻漿，離心取上清液，其蛋白濃度用BCA法測(cè)定，將含有50 μg蛋白的上清液用SDS-PAGE電泳分離，并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS-T中和硝酸纖維素膜降低非特異性結(jié)合。一抗孵育，沖洗后再用二抗孵育，采用ECL試劑盒檢測(cè)。條帶用Gel-Pro圖像分析系統(tǒng)掃描定量。重復(fù)3次。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

制備細(xì)胞爬片，PBS沖洗后加入4℃丙酮固定15 min。0.1%Triton-X 100浸泡10 min打孔，加入正常血清封閉液，加入一抗工作液(1∶50稀釋)，陰性組對(duì)照組以PBS代替一抗，濕盒中4℃過(guò)夜，加入二抗工作液(1∶100稀釋)，37 ℃孵育20 min，加入 DAPI工作液，避光室溫下復(fù)染10 min。激發(fā)波長(zhǎng)364 nm，發(fā)射波長(zhǎng)488 nm，探測(cè)DAPI的藍(lán)色熒光;激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，探測(cè)FITC綠色熒光和激發(fā)波長(zhǎng)547 nm，發(fā)射波長(zhǎng)620 nm，探測(cè)TRITC的紅色熒光。掃描速度:慢掃描。CLSM下觀察并用Leica Confocal圖像分析軟件照相。采用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量積分吸光密度(IA)。重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)錄入和處理均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，分析前采用One Sample Kolmoglrov-Smirnov Z test檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)描述，2組樣本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣本比較采用單因素方差分析，方差齊者采用 Bonferroni法，不齊者采用Tambane'sT2法;非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法(k個(gè)獨(dú)立樣本的檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖下調(diào)體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞beclin1的表達(dá)

24 h Glu組beclin1蛋白表達(dá)較Con組顯著降低(P＜0.05)。其余各時(shí)間點(diǎn)兩組之間beclin1蛋白表達(dá)無(wú)差異(圖1A)。RSC96細(xì)胞中的beclin1蛋白被標(biāo)記為紅色熒光，細(xì)胞質(zhì)被標(biāo)記為綠色熒光，細(xì)胞核被標(biāo)記為藍(lán)色熒光。Con組可見紅色熒光呈點(diǎn)片狀分布，主要集中在細(xì)胞核周圍區(qū)域內(nèi)。Glu組紅色熒光強(qiáng)度較Con組明顯減弱(圖1B)。半定量分析顯示(圖1C)，Glu組紅色熒光IA值較Con組明顯降低(P＜0.05)。

2.2 高濃度葡萄抑制體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的增殖活性

6及24 h時(shí)各組A值無(wú)明顯差異，48 h時(shí)Glu組A值較Con組顯著減低(P＜0.05)，72 h時(shí)與Con組比較Glu組A值減低更加明顯(P＜0.01)(圖2)。

圖1 高濃度葡萄糖對(duì)體外培養(yǎng)RSC96細(xì)胞beclin1表達(dá)的影響Fig 1 The effect of the high concentration of glucose on beclin1 level of RSC96 cells in vitro

2.3 抑制自噬增加高濃度葡萄對(duì)外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞增殖活性的削弱作用

與Con組比較，Glu組、Con+3-MA組及Glu+3-MA組A值均下降(P＜0.01)。與Glu組比較，Con+3-MA與Glu+3-MA組A值均下降(P＜0.01)。Con+3-MA與Glu+3-MA組間A值無(wú)明顯差異(圖3)。

2.4 抑制自噬增加caspase-3的活化

各組間caspase-3酶原的表達(dá)無(wú)明顯差異。與Con組比較，Glu及Con+3-MA組P20亞基表達(dá)無(wú)明顯增多。Glu+3-MA組P20亞基蛋白表達(dá)水平則較Con+3-MA組上調(diào)(P＜0.05);較Con組和Glu組明顯上調(diào)(P ＜0.01)(圖4A，B)。

3 討論

在生長(zhǎng)因子缺乏等病理狀態(tài)下，細(xì)胞可形成雙層膜結(jié)構(gòu)包裹細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的自噬體，再與溶酶體融合形成自噬溶酶體，以降解其中的底物產(chǎn)生磷脂和蛋白質(zhì)等物質(zhì)［1］。借此機(jī)體不僅清除了受損的細(xì)胞器，而且產(chǎn)生的蛋白質(zhì)等又可作為原料重新參與代謝，為細(xì)胞提供能量，維持其存活。DPN患者神經(jīng)組織長(zhǎng)期處于缺血缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和神經(jīng)因子缺乏的狀態(tài)以及持續(xù)存在的氧化應(yīng)激損傷是自噬現(xiàn)象出現(xiàn)異常的前提和基礎(chǔ)。然而，目前有關(guān)自噬與DPN關(guān)系的研究較少。僅有文獻(xiàn)報(bào)道在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠脊髓背根神經(jīng)元中自噬現(xiàn)象明顯增多，經(jīng)DPN患者血清體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞也可見自噬現(xiàn)象，自噬可能在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到保護(hù)作用［6－7］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Glu組beclin1蛋白的表達(dá)水平較Con組明顯減少。beclin1是目前常用的自噬檢測(cè)指標(biāo)之一，其參與自噬體形成的啟動(dòng)過(guò)程，表達(dá)與自噬的發(fā)生正相關(guān)［8］。綜合免疫組織化學(xué)和 Western bolt的檢測(cè)結(jié)果，本研究初步認(rèn)為高濃度葡萄糖將減少雪旺細(xì)胞中的自噬發(fā)生。

自噬在糖尿病慢性并發(fā)癥時(shí)具有何種病理生理作用目前尚不清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為自噬可能具有延緩慢性并發(fā)癥進(jìn)展的作用［2］。與既往研究結(jié)果一致［4］，本研究也證實(shí)高濃度葡萄糖能抑制體外培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞的增殖活性，并且發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3-MA抑制自噬后，加劇了高糖對(duì)雪旺細(xì)胞增殖活性的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)室既往曾觀察到高濃度葡萄糖能夠上調(diào)體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞中caspase-3表達(dá)［5］。那么自噬加劇高濃度葡萄糖對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的抑制作用是否同通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡途徑的而實(shí)現(xiàn)呢?此次研究發(fā)現(xiàn)自噬被抑制后，caspase-3的活化亦隨之上調(diào)。故推測(cè)自噬活性降低可能是高濃度葡萄糖增加細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，推測(cè)高濃度葡萄糖通過(guò)下調(diào)自噬活性增加細(xì)胞凋亡，而造成細(xì)胞的損傷。這可能是DPN發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一。自噬可能是機(jī)體抵抗來(lái)自內(nèi)外損傷因素的一種重要途徑。糖尿病時(shí)可能抑制了正常的自噬活性，從而削弱了機(jī)體的自我修復(fù)能力，因此造成了包括DPN在內(nèi)的各種并發(fā)癥的發(fā)生。然而，本研究尚未完全揭示高糖條件下自噬下調(diào)的分子機(jī)制。今后應(yīng)進(jìn)一步闡明高糖減少自噬的信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及探討自噬對(duì)細(xì)胞凋亡影響的具體作用靶點(diǎn)。盡管如此，通過(guò)自噬防御途徑使機(jī)體減輕高糖、氧化應(yīng)激損傷等帶來(lái)?yè)p害，從而減少慢性并發(fā)癥的發(fā)生和進(jìn)展，可能會(huì)為DPN的預(yù)防和治療提供嶄新的思路。

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