熱毒寧注射液中梔子苷的降解動(dòng)力學(xué)研究

張慧杰， 任曉亮， 邱喜龍， 蕭 偉， 戚愛棣*

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193;2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001;3.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (籌)，江蘇連云港222001)

熱毒寧注射液是由梔子、青蒿、金銀花等制成的中藥復(fù)方制劑，具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，臨床用于上呼吸道感染 (外感風(fēng)熱證)所致的高熱、微惡風(fēng)寒、頭身痛、咳嗽、痰黃等癥及手足口病的治療，具有很好的臨床療效［1-4］。梔子苷是熱毒寧注射液的主要有效成分之一，也是梔子所含有的主要活性成分和指標(biāo)性成分［5］，為環(huán)烯醚萜苷類化合物 (圖1)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖、抗腫瘤等藥理活性［6-7］。以梔子苷為活性成分的藥物具有廣泛應(yīng)用，但是未見到梔子苷降解動(dòng)力學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)就梔子苷對(duì)照品及熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH、溫度下的降解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了相關(guān)研究［8-9］，為其保存和使用提供參考。

圖1 梔子苷結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of geniposide

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters 600E-2487高效液相色譜系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司);AX205分析天平 (瑞士METTLER TOLEDO公司);XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠);恒溫水浴 (天津市泰斯特儀器有限公司);DELTA 320 pH計(jì) (瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 材料 梔子苷對(duì)照品 (純度≥98%，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):110609)，熱毒寧注射液 (江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):110601)，乙腈 (色譜純，美國(guó)Sigma公司)，甲酸 (色譜純，美國(guó)Tedia公司)，甲醇 (天津市康科德科技有限公司)，超純水 (Millipore超純水凈化系統(tǒng)制得)，75%醫(yī)用酒精;磷酸二氫鈉、磷酸、氫氧化鈉均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 梔子苷測(cè)定方法［10-12］

2.1.1 色譜條件 Waters Symmetry ShieldTMRP18色譜柱 (4.6 mm ×150 mm，5μm);流動(dòng)相為0.3%甲酸溶液 (A)－乙腈 (B)(梯度洗脫，見表1);體積流量1 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm;進(jìn)樣量10μL。

表1 HPLC梯度洗脫程序Tab.1 The gradient elution

2.1.2 線性關(guān)系的考察 精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，加甲醇稀釋成含梔子苷質(zhì)量濃度分別為1、2.5、5、10、20、40、50μg/mL的溶液。分別吸取10μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以梔子苷質(zhì)量濃度 (C)為橫坐標(biāo)，峰面積 (A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 A=20 672 659.44C+2 968.04，r=1.000。結(jié)果表明，梔子苷在1.0～50μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。其色譜圖見圖2。

圖2 梔子苷降解色譜圖比較Fig.2 Chromatogram s of geniposide and sam ples

2.1.3 精密度 取2.1.2項(xiàng)下質(zhì)量濃度為20μg/mL的溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得RSD值為0.60%。表明儀器及進(jìn)樣精密度良好。

2.1.4 加樣回收率 精密稱取梔子苷對(duì)照品適量，置于10 mL棕色量瓶中，配制成18.3μg/mL的梔子苷溶液。分別吸取適量熱毒寧注射液及已配制的梔子苷溶液置10mL棕色量瓶中，渦旋混勻，以甲醇定容至刻度。取上述溶液10μL進(jìn)HPLC測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，通過外標(biāo)法計(jì)算，得平均加樣回收率為99.01%，RSD為1.5%。

2.2 梔子苷水溶液在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性研究

2.2.1 緩沖溶液的配制 取適量磷酸二氫鈉、磷酸及氫氧化鈉配制 pH值分別為 0.99、2.05、2.96、4.06、 5.09、 6.01、 6.94、 8.01、 9.06、9.87、11.06、12.02、12.88的一系列緩沖溶液。

2.2.2 貯備液的配制 將10 mL棕色量瓶滅菌后，稱取10.79 mg梔子苷，置于量瓶中，以純水定容，配制質(zhì)量濃度為1.079 mg/mL的貯備液。

2.2.3 梔子苷在不同pH下的穩(wěn)定性研究 移取250μL貯備液置于10 mL滅菌量瓶中，以一系列的緩沖溶劑定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC法測(cè)定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

將樣品溶液密封并于室溫條件下放置，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中梔子苷的殘余濃度 (ct)。由不同時(shí)間梔子苷相對(duì)剩余濃度的對(duì)數(shù)［ln(ct/c0)］對(duì)時(shí)間 (t)作圖，見圖3。將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果可得梔子苷的降解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其相關(guān)動(dòng)力學(xué)方程、線性相關(guān)系數(shù)(r)及降解速率常數(shù) (k)見表2。pH與k值的關(guān)系見圖4。由圖4可知，梔子苷降解的整體趨勢(shì)是隨溶液堿性的增加，降解速率加快。

圖3 梔子苷水溶液在不同pH緩沖溶液中的降解曲線Fig.3 The relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in aqueous solution under different pH

表2 梔子苷在不同pH緩沖溶液中的降解參數(shù)Tab.2 K inetic parameters for geniposide under different pH

圖4 梔子苷在不同pH緩沖溶液降解規(guī)律Fig.4 Degradation of geniposide under different pH

2.2.4 梔子苷在不同溫度下的穩(wěn)定性研究 移取250μL貯備液置于10 mL滅菌量瓶中，以pH為7.27的超純水定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測(cè)定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

將樣品溶液密封，分別置于溫度為60、70、80、90℃的恒溫水浴鍋中，間隔一定的時(shí)間對(duì)樣品取樣，測(cè)定溶液中梔子苷的殘余濃度 (ct)。由不同時(shí)間梔子苷相對(duì)剩余濃度的對(duì)數(shù) ［ln(ct/c0)］對(duì)時(shí)間(t)作圖，見圖5。將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行擬合，由擬合結(jié)果可知梔子苷在60、70、80、90℃下的降解過程均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其相關(guān)動(dòng)力學(xué)方程、線性相關(guān)系數(shù) (r)、降解速率常數(shù) (k)及溫度系數(shù) (Q10)見表3。根據(jù)阿侖尼烏斯方程 ［見公式 (1)］，由各個(gè)溫度下的降解速率常數(shù)的對(duì)數(shù)ln k對(duì)絕對(duì)溫度的倒數(shù)1/T作圖，得圖6，擬合曲線的斜率為 (Ea/R)，經(jīng)計(jì)算，pH值為7.27，溫度為60～90℃的條件下，梔子苷降解活化能Ea=128.08 kJ/mol。

圖5 梔子苷水溶液在不同溫度下的降解曲線Fig.5 The relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in aqueous solution under different tem peratures

圖6 梔子苷降解速率 (ln k)與溫度 (1/T)之間的關(guān)系Fig.6 Relationship between lnk and 1/T

2.3 熱毒寧注射液中梔子苷在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性研究

2.3.1 熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH下的穩(wěn)定性研究 將10 mL棕色量瓶滅菌后，取500μL熱毒寧注射液，置于量瓶中，以一系列的緩沖溶劑定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測(cè)定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

按2.2.3項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，將測(cè)定結(jié)果進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果可得梔子苷的降解過程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué) (圖7)，其降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表2。其中在pH1的環(huán)境下，梔子苷量基本保持不變，因此未在圖表中列中。pH與k值的關(guān)系見圖4，可以發(fā)現(xiàn)不同pH下，熱毒寧注射液中梔子苷與梔子苷對(duì)照品水溶液的降解趨勢(shì)一致。

圖7 熱毒寧注射液中梔子苷在不同pH緩沖溶液中的降解曲線Fig.7 Relationship between the logarithms of residual content(lnct/c0)for geniposide in Reduning Injection under different pH

2.3.2 熱毒寧注射液中梔子苷在不同溫度下的穩(wěn)定性研究 將10 mL棕色量瓶滅菌后，取500μL熱毒寧注射液，置于量瓶中，以pH為7.27的超純水定容，渦旋混勻，制得樣品溶液，并分別用HPLC測(cè)定溶液中梔子苷的初始濃度 (c0)。

按2.2.4項(xiàng)下方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定、擬合測(cè)定結(jié)果并計(jì)算降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，表明熱毒寧注射液中梔子苷在60、70、80、90℃下的降解過程均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué) (圖8)，其降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3，經(jīng)計(jì)算圖6，pH值為7.27，溫度為60～90℃的條件下，熱毒寧注射液中梔子苷降解活化能Ea=79.19 kJ/mol。

經(jīng)多次平行的降解試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)趨勢(shì)基本一致。將水溶液及熱毒寧注射液中的梔子苷在不同pH條件下的降解速率常數(shù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示二者無顯著性差異 (P＞0.05)。由表2、表3可以看出，梔子苷對(duì)強(qiáng)堿及高溫比較敏感，無論在水溶液中還是在熱毒寧注射液中均較為穩(wěn)定。

表3 梔子苷不同溫度下的降解參數(shù)Tab.3 Kinetic parameters for geniposide in different temperatures

圖8 熱毒寧注射液中梔子苷不同溫度下的降解曲線Fig.8 Relationship between the logarithms of residual content(ln c t/c0)for geniposide in Reduning Injection under different temperatures

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)比較了兩種流動(dòng)相系統(tǒng)，分別是乙腈-水和乙腈-甲酸水溶液，結(jié)果表明采用后一種流動(dòng)相系統(tǒng)可以使注射液中的成分得到更好的分離，使峰形更好，經(jīng)對(duì) 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲酸水溶液的比較，發(fā)現(xiàn)采用0.3%、0.4%、0.5%甲酸水溶液時(shí)色譜峰分離情況及峰形相差不多，最終采用了乙腈－0.3%甲酸水溶液系統(tǒng)。熱毒寧注射液中成分較多，為使注射液成分完全分離，因此采用梯度洗脫的方法，首先采用了在0～20 min內(nèi)將乙腈比例由5%增加至30%的方法，保留時(shí)間為11 min附近的峰分離度不能滿足要求，更改梯度后，乙腈在前5 min內(nèi)由5%升至10%，且后面保持15%的比例，能使色譜峰的分離情況良好，綜合節(jié)省分析時(shí)間等因素，采用表1所示的梯度條件。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，梔子苷的降解屬于一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，不同pH環(huán)境下，根據(jù)梔子苷在不同pH下的反應(yīng)常數(shù)趨勢(shì)，推測(cè)出梔子苷降解反應(yīng)屬于堿催化。梔子苷是一種環(huán)烯醚萜苷類化合物，其結(jié)構(gòu)中具有易分解的糖苷鍵和酯鍵，在堿性條件下易發(fā)生斷裂，而其結(jié)構(gòu)中的羥基具有弱酸性，可以耐受酸性和弱堿性條件，故其降解趨勢(shì)具有圖4所顯示出的特征。梔子苷無論在水溶液中還是在熱毒寧注射液中均較為穩(wěn)定，本試驗(yàn)為梔子苷的使用、貯存及制劑研究提供了依據(jù)。通過梔子苷對(duì)照品與熱毒寧注射液中梔子苷的降解情況比較，可以看出制劑工藝未使梔子苷穩(wěn)定性發(fā)生顯著性改變，其原因與輔料、制劑工藝等多種因素有關(guān)，有待深入研究。

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