中壓制備液相色譜快速分離制備兒茶素單體

林 丹，李春苗，鮮 殊，王 璽，宛曉春，凌鐵軍，李大祥

安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部茶葉生物化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036

茶葉中的多酚類(lèi)物質(zhì)占茶葉干重的18%～36%。其中兒茶素類(lèi)(Catechins，圖1)占茶多酚總量的70% ～80%［1］。近年研究表明，兒茶素具有清除自由基和抗氧化、調(diào)節(jié)血脂等多種生物活性和藥理功能［2-6］。

目前兒茶素單體的制備方法［7-9］主要有吸附樹(shù)脂法、Sephadex LH-20凝膠柱色譜法、硅膠柱色譜法和高速逆流色譜法等，這些方法均不能一步得到高純度的四種主要兒茶素單體，且收率較低。中壓制備色譜作為一種現(xiàn)代制備色譜技術(shù)近年來(lái)在天然植物成分分離中得到較多應(yīng)用，它不僅具有常壓色譜上樣量大的優(yōu)點(diǎn)，而且有制備型高壓色譜高效分離的特點(diǎn)，具有經(jīng)濟(jì)快捷的優(yōu)勢(shì)，適用于中藥有效成分的快速分離和制備［10-12］。中壓制備色譜法介于常壓色譜和制備型高壓色譜(preparative-HPLC)之間，其恒流泵的壓力為70～300 psi，流量可達(dá)每分鐘數(shù)百毫升，保證了較快的分離速度［13］。本文以茶多酚為原料，利用反相中壓C18制備液相色譜，一步快速得到四種主要兒茶素的高純度單體，這在茶葉兒茶素單體的分離中尚屬首次報(bào)道。本法具有操作簡(jiǎn)便快捷，單體回收率較高，純度高等優(yōu)點(diǎn)，研究結(jié)果為茶葉中四種主要兒茶素單體的制備工藝提供了一種重要參考。

圖1 茶葉中四種主要兒茶素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of four major catechins in tea

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

茶多酚，提取自安徽市售綠茶，經(jīng)福林酚法測(cè)得多酚含量為92.6%(沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物);甲醇，無(wú)水乙醇，95%乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純;水為一級(jí)蒸餾水;ODS-AQ中壓色譜柱(利穗科技有限公司，蘇州);中壓制備液相色譜儀DR FLASHⅡ(利穗科技有限公司，蘇州);日立L-2000液相色譜儀(天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司);R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(申生科技有限公司，上海);真空干燥箱(MMM，德國(guó));NMR Avance 400核磁共振儀(Bruker-Biospin，美國(guó));LTQ Orbitrap XL質(zhì)譜儀(Thermo Fisher，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶多酚HPLC檢測(cè)

取少量茶多酚溶于1 mL水中，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液待上樣。HPLC檢測(cè)條件見(jiàn)1.2.3。

1.2.2 兒茶素單體制備

稱取茶多酚1 g，經(jīng)95%乙醇沉淀后，上清真空旋蒸至干，水溶后上樣。樣品經(jīng)過(guò)中壓制備液相色譜C18反相柱分離純化，以紫外－可見(jiàn)光檢測(cè)器檢測(cè)，收集225 nm有吸收的物質(zhì)，每30 mL收集一個(gè)餾分，經(jīng)HPLC檢測(cè)后合并相同組分的餾分，減壓濃縮、真空干燥，得四種兒茶素單體，共560 mg。其具體純化制備條件如下:

色譜柱:C18(ODS-AQ)PP手?jǐn)Q色譜柱(125 mm ×26 mm，30 ～50 μm，40 g)，二根串聯(lián);柱溫∶室溫;流動(dòng)相∶A相∶水;B相∶甲醇;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm，225 nm;流速30 mL/min;壓力范圍:120～150 psi;上樣量:500 mg/次(二次上樣);

洗脫梯度:0～3 min:B相10%，3～13 min:B相20%，13～18 min:B相20% ～24%，18～60 min:B相24%，60～65 min:B相24% ～32%，65～80 min:B相32%，80～90 min:B相32% ～100%，90～100 min:B相100%。

1.2.3 樣品檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定

HPLC檢測(cè)條件。色譜柱:C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:A 相:水;B 相:甲醇;檢測(cè)器波長(zhǎng):280 nm，225nm;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;洗脫梯度:0～5 min:B相15%，5～35 min:B相15% ～30%，35～40 min:B相30%，40～45 min:B相30% ～100%，45～50 min:B相100% ～15%。

結(jié)構(gòu)鑒定:測(cè)試化合物的NMR氫譜和碳譜，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析;采用高分辨質(zhì)譜儀測(cè)試化合物的分子質(zhì)量和分子式信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚HPLC檢測(cè)

茶多酚經(jīng)HPLC檢測(cè)后，可以看出其中有四種相對(duì)含量較高的物質(zhì) EGC、EGCG、EC和 ECG(圖2)，其含量分別為 12.3%，42.4%，9.7%，17.7%，四者含量共占多酚總量的82.1%。

圖2 茶多酚HPLC檢測(cè)圖譜(225 nm)Fig.2 HPLC chromatogram of tea polyphenols(225 nm)

2.2 兒茶素單體分離制備

茶多酚經(jīng)過(guò)中壓制備液相色譜分離，根據(jù)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果自動(dòng)收集在225 nm下有吸收的物質(zhì)，每一試管收集30 mL，共收集94管，根據(jù)色譜峰合并后經(jīng)減壓濃縮干燥得到四種兒茶素單體(圖3)，分別為EGC:90 mg，純度為91.8%(如圖4，峰面積之比，下同);EGCG:355 mg，純度為 97.6%;EC:23 mg，純度為 97.7%;ECG:92 mg，純度 99.3%。四種主要兒茶素純品總量為560 mg，得率達(dá)56.0%。而1 g茶多酚中四種主要兒茶素含量為82.1%，因此四種兒茶素單體總回收率為68.2%(560 mg/(1.0g×82.1%))。可見(jiàn)本法簡(jiǎn)單易行，從茶多酚中可一次分離制備四種高純度的兒茶素單體，樣品純度均在90%以上，且得率和回收率均較高。

2.3 兒茶素單體NMR結(jié)構(gòu)確證及質(zhì)譜確證

圖3 兒茶素單體中壓色譜制備圖譜Fig.3 Preparative MPLC chromatogram of the catechins

圖4 分離后得到四種兒茶素單體的HPLC圖譜(225 nm)Fig.4 HPLC chromatogram of the separated catechins(225 nm)

對(duì)純化所得四種兒茶素單體進(jìn)行核磁共振分析及質(zhì)譜分子式確證。核磁共振分析數(shù)據(jù)如表1和2(核磁共振譜圖如圖 5 ～ 圖8)，經(jīng)與文獻(xiàn)［14，15］報(bào)道的數(shù)據(jù)比對(duì)，可確認(rèn)四種單體為兒茶素 EGC、EGCG、EC、ECG。對(duì)四種主要兒茶素進(jìn)行 HRESIMS分析得到，EGC:m/z 305.06583［M －H］-，(calcd.for，305.06668);EGCG:m/z 457.07654 ［M － H］-，(calcd.for，457.07764);EC:m/z 289.07083 ［M － H］-，(calcd.for289.07122);ECG:m/z 441.08136 ［M － H］-，(calcd.for，441.08272)。該結(jié)果提供的分子式信息分別與四種兒茶素單體相符。

表1 四種兒茶素單體的氫譜數(shù)據(jù)(in Acetone-d6，δ in ppm，J in Hz)Table 1 1H NMR spectroscopic data of four catechins(in Acetone-d6，δ in ppm，J in Hz)

表2 四種兒茶素單體的碳譜數(shù)據(jù)(in Acetone-d6，δ in ppm)Table 2 13C NMR spectroscopic data of four catechins(in Acetone-d6，δ in ppm)

8a 157.1 157.1 157.2 157.2 1' 131.5 130.8 132.3 131.4 2' 106.9 106.8 115.5 114.9 3' 146.2 146.3 145.4 145.6 4' 132.9 133.2 145.3 145.5 5' 146.2 146.3 115.3 115.7 6' 106.9 106.8 119.4 119.3 1'' － 121.9 － 121.8 2''，6'' － 110.0 － 110.0 3''，5" － 145.9 － 145.9 4'' － 138.7 － 138.8 C=O － 166.1 － 166.1

3 討論

本文從茶多酚中制備了四種高純度兒茶素單體EGC、EGCG、EC、ECG。目前較成熟的兒茶素純化方法有吸附樹(shù)脂、凝膠、硅膠為填料的柱層析方法［7，8］和高速逆流色譜分離方法［9］。而本文以中壓制備級(jí)的C18反相硅膠為填料，利用中壓制備液相色譜儀直接從茶多酚中一步快速制備出四種高純度兒茶素單體，且回收率相對(duì)較高，為茶葉中活性成分兒茶素單體的純化研究提供了參考。此外，C18反相填料還常用于一些大極性化合物的分離制備，其可重復(fù)使用多次，成本低，環(huán)境污染小。

在使用中壓制備色譜制備兒茶素單體的過(guò)程中檢測(cè)波長(zhǎng)采用225 nm，而非更常見(jiàn)的280 nm，這主要是因?yàn)閮翰杷卦?25 nm下的吸收強(qiáng)于280 nm，并且本研究中應(yīng)用的中壓制備色譜的檢測(cè)器為高通量檢測(cè)器，其流通池的厚度為HPLC檢測(cè)器流通池厚度的1/20，即同濃度物質(zhì)吸收強(qiáng)度的AU值在中壓制備色譜上是HPLC上的1/20，其目的是制備單體的過(guò)程中可加大上樣量并保證吸收值不會(huì)超過(guò)檢測(cè)器的檢測(cè)限。實(shí)驗(yàn)中EGC單體制備后的純度為91.8%，純度相對(duì)其他三種兒茶素單體較低，從HPLC分析(圖4)中可看出其在反相C18分離體系中與另一種兒茶素單體C靠得很近，所以用反相C18填料很難將EGC與C在一次分離中很好的分開(kāi)，所以其純度相對(duì)不高。如何利用C18填料一次制備出更高純度的EGC，還有待后續(xù)深入研究。

本研究中四種主要兒茶素的回收率為68.2%，相對(duì)不是特別高，這主要是由于上樣量較大(80 g C18填料，上樣量1 g)，為了獲得高純度的單體，舍棄了EGCG和EC中間交叉的洗脫液;同樣，EGC前面的小雜質(zhì)峰與EGC靠的比較近，舍棄了部分EGC峰前部洗脫液。因此在以后的放大制備實(shí)驗(yàn)中，若能充分考慮到上樣量的問(wèn)題，優(yōu)化樣品的洗脫條件來(lái)減少交叉部分，還將會(huì)進(jìn)一步提高四種兒茶素單體的回收率。

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