倒卵葉五加及復(fù)方佳蓉片對衰老大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2、Bax的作用＊

謝艷華 楊 倩 周暄宣 朱愛華 同卓斌 張芳霞 王四旺 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院天然藥物學(xué)教研室（西安 710032）

研究表明細(xì)胞凋亡通過破壞重要的不能再生的細(xì)胞對衰老起負(fù)面影響[1]，伴隨衰老的發(fā)生，心肌、腦組織、腎上腺等多種組織器官的細(xì)胞凋亡過度增加[2]，推進(jìn)衰老進(jìn)程。衰老可使睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，將誘導(dǎo)睪丸組織細(xì)胞凋亡[3]。倒卵葉五加具有健脾益氣、補(bǔ)腎寧心、舒筋活絡(luò)的功能，適用于體虛乏力，食欲不振，腰膝酸軟，陽痿，失眠多夢，健忘，風(fēng)寒濕痹等。我們前期研究證實(shí)，倒卵葉五加和佳蓉片可抑制衰老大鼠抗氧化能力的降低，具有明顯延緩衰老的作用；機(jī)制可能與其抗氧化和降低衰老大鼠睪丸組織中NO和iNOS的含量有關(guān)[4－5]。本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討倒卵葉五加和佳蓉片對亞急性衰老大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2、Bax的影響。

1 材料與方法

1.1 試 劑 D-半乳糖，批號201112B09，北京化學(xué)試劑公司，采用生理鹽水配成6%的溶液。倒卵葉五加浸膏，含生藥量3.8g／g浸膏，批號2011091201，由寶雞飲片廠出品；佳蓉片，批號201111032，陜西博愛制藥有限公司出品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠，8周齡，雄性60只，體重200～250g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，動物合格證號：SCXK（軍）字第2007-007號。實(shí)驗(yàn)環(huán)境為SPF級。動物隨機(jī)分為正常組、模型組、倒卵葉五加組、佳蓉片組、維生素E組，每組12只大鼠。D-半乳糖連續(xù)腹腔注射（320mg／kg，50d）建立亞急性衰老大鼠模型，各組大鼠在腹腔注射D-半乳糖（正常組動物注射等量生理鹽水）的同時，正常和模型組大鼠灌胃生理鹽水（10mL／kg）、其他各組依次給予倒卵葉五加（1g／kg）、佳蓉片（6g／kg）、維生素E（20mg／kg），用藥50d。

1.3 標(biāo)本采集與處理 各組大鼠末次給藥后眼內(nèi)眥取血2mL后，行左心室快速灌注DEPC處理的生理鹽水約250mL，取睪丸組織用多聚甲醛固定、石蠟包埋、免疫組化染色。

1.4 血清睪酮測定 取血樣本，1200rpm／min離心15min，上清液于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。按試劑盒方法測定血清睪酮含量。

1.5 免疫組織化學(xué) 按照SP方法操作。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果，每組至少計數(shù)10只大鼠，每只大鼠計數(shù)5張切片，通過Imageproplus圖像分析軟件測定每張切片中的10個視野陽性細(xì)胞的平均光密度（MOD）值，計算平均值，代表蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以（）表示，組間資料應(yīng)用單因素方差分析，組間比較采用S-N-K法檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有顯著意義；P＜0.01表示差異有非常顯著意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清睪酮濃度 結(jié)果見表1。倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E各組大鼠血清睪酮濃度較模型組明顯升高，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），表明D-半乳糖致亞急性衰老大鼠血清睪酮濃度明顯下降。

表1 血清睪酮濃度測定結(jié)果（ng／mL，）

表1 血清睪酮濃度測定結(jié)果（ng／mL，）

注：與模型組比較△P＜0.05，▲P＜0.01

組 別 n 劑量（mg／kg） 血清睪酮含量正常組 12 等量NS 15.562±0.325△模型組 12 320 14.916±0.489倒卵葉五加 12 1000 15.425±0.328△佳蓉片 12 6000 15.327±0.419△維生素E 12 20 15.892±0.431▲

2.2 免疫組化結(jié)果 表2顯示，模型組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白陽性表達(dá)為棕黃色；倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E各組的陽性表達(dá)明顯高于模型組，其差異均具有顯著或非常顯著意義（P＜0.05或P＜0.01）。Bax結(jié)果顯示倒卵葉五加、佳蓉片和維生素E各組的陽性表達(dá)明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2和bax蛋白陽性表達(dá)結(jié)果（MOD值，）

表2 各組大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2和bax蛋白陽性表達(dá)結(jié)果（MOD值，）

注：與模型組比較△P＜0.05，▲P＜0.01

組 別 n Bcl-2 Bax正常組 12 0.4785±0.0036▲ 0.4756±0.0048▲模型組 12 0.3891±0.00440.5459±0.0053倒卵葉五加 12 0.4543±0.0045▲ 0.4701±0.0043▲佳蓉片 12 0.4452±0.0041△ 0.4815±0.0040△維生素E 12 0.4521±0.0052△ 0.4801±0.0052△

3 討 論

細(xì)胞凋亡（appoptosis）的分子和生化機(jī)制迄今尚不完全清楚，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其形成主要與Bcl-2基因家族相關(guān)。細(xì)胞調(diào)亡進(jìn)程一般分3個時相，即誘導(dǎo)期，效應(yīng)期和降解期。誘導(dǎo)期的細(xì)胞在接受各種外來信號引發(fā)效應(yīng)；進(jìn)入效應(yīng)期決定細(xì)胞存活或死亡的分子調(diào)控，調(diào)控分子包括原癌基因和抑癌基因，其中Bcl-2家族起著決定作用；到了降解期可見到凋亡現(xiàn)象。Bcl-2是一種原癌基因，由Tsujimoto等人在人淋巴瘤細(xì)胞中克隆得到，是線蟲抑凋亡基因CED-9的同源物，目前發(fā)現(xiàn)有三十多個成員，發(fā)揮著凋亡監(jiān)測作用。Bcl-2家族蛋白分為三個亞家族；抑凋亡蛋白家族包括 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等真核細(xì)胞蛋白以及 E1B-19、BHRF1、KS-Bcl-2等病毒蛋白，促凋亡蛋白家族包括Bax亞家族和BH3-only亞家族。Bcl-2及其類似物Bcl-xl、Bcl-w能抑制多種刺激引起細(xì)胞凋亡，它們定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和細(xì)胞核膜上，Bcl-2通常位于膜上而Bcl－w和Bcl-xl則在細(xì)胞受到凋亡刺激時通過構(gòu)象變化結(jié)合到膜上[6]。

Bax和Bak研究的較多，主要通過線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑發(fā)揮作用。在正常細(xì)胞中Bax位于胞漿以單體可溶性蛋白形式存在，在接受凋亡刺激后Bax發(fā)生構(gòu)象變化插入線粒體外膜，形成多聚體；Bak通常位于線粒體膜上，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時也發(fā)生構(gòu)象變化引起多聚體形成。

Bcl-2蛋白在細(xì)胞中過量表達(dá)時，可與全部Bax結(jié)合，細(xì)胞成活，凋亡抑制。但當(dāng)Bax過量存在，與Bcl-2形成異源二聚體，則細(xì)胞凋亡。哺乳動物睪丸內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)及比值變化，睪丸細(xì)胞凋亡數(shù)隨之變化，結(jié)構(gòu)和功能將出現(xiàn)異常[7－9]。本研究結(jié)果顯示應(yīng)用倒卵葉五加和佳蓉片干預(yù)后Bcl-2蛋白的表達(dá)增加；Bax蛋白的表達(dá)減少；且倒卵葉五加組效果最好，說明倒卵葉五加可以調(diào)節(jié)凋亡蛋白的表達(dá)，抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的凋亡，減輕D－半乳糖所致亞急性衰老模型大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損傷。

[1]Wamer HR，Ho des RJ.What does cell death have to do with aging？[J].J Am Geriatr Soc，1997，45（10）：1140-1146.

[2]Geng YJ，Ishikawa Y，Vatner DE，et a1.Apoptosis of cardiacmyoeytes in Gsalpha transgenic mice[J].Circ Res，1999，84（1）：3442.

[3]郭 銀，牛嗣云，高 福，等.何首烏飲對過度訓(xùn)練大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞Bcl-2、Bax的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：589-590.

[4]楊 倩，謝艷華，周暄宣，等.倒卵葉五加及其復(fù)方對大鼠的抗衰老作用[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報（已錄用，待發(fā)表）.

[5]田振軍，林琴琴，黨利農(nóng).運(yùn)動訓(xùn)練對大鼠睪丸組織NOS、Bax、Bel-2表達(dá)的影響[J].西安體育學(xué)院學(xué)報，2007，24（1）：63.

[6]Youle RJ.Strasser A.The Bcl-2Protein family：opposing activities that mediate cell death[J].Nat Rew Mol Ceel Biol，2008，9（1）：47.

[7]陳 偉，舒小林，陸 祥，等.As2O3對大鼠生精細(xì)胞凋亡及其 Bcl-2／Bax表達(dá)的變化[J].中國中藥雜志，2008，33（23）：2823.

[8]Sun J，Ying M，Li H.Role of UCH-L1／ubiquitin in acute tes.tieular isehemia-repefusion injury[J].Biochem Biophys Res Corn-Bun，2008，366（2）：539.

[9]Kim KH，Joo KJ，Park HJ，et a1.Nicotine induces apoptosis in TM3mouse Leydin cells[J].Fertil Steril，2005，83（1）：1093.