何首烏生品及不同炮制品中大黃素含量測(cè)定＊

黃玉劍 王秦勇 丁 瑾 衛(wèi)培峰 陜西省渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院（渭南 714000）

何首烏始載于《開(kāi)寶本草》，為蓼科蓼屬植物何首烏（Polygonummultiflorum Thunb）的塊根，經(jīng)過(guò)炮制后具有補(bǔ)益精血，固腎烏須之功，該藥歷來(lái)為古今醫(yī)家、飲食家所推崇，近幾年來(lái)許多補(bǔ)血類(lèi)中成藥、保健食品中均將制首烏作為主要成分之一，應(yīng)用較為廣泛。近幾年國(guó)內(nèi)外報(bào)道[1]的何首烏不良反應(yīng)日漸增多，且主要集中在肝臟不良反應(yīng)，因而何首烏安全性問(wèn)題引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的高度關(guān)注。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2]，何首烏中大黃素可能為何首烏的毒性成分，而該成分與炮制方法關(guān)系密切，因此本文就何首烏生品及不同炮制品中大黃素進(jìn)行測(cè)定，以探討分析不同何首烏炮制品致肝損傷的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器高效液相色譜儀（Lab Alliance型恒流泵；Waters966二極管陣列檢測(cè)器；活德國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Millennium 32色譜工作站）、C18色譜柱（Diamosil 4.6×250mm，5μm）、BP211D型分析天平（德國(guó)賽多利斯）、TGL-16G離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、FOEA26810D型純水機(jī)（Millipore公司）。

所用化學(xué)試劑為分析純（天津富宇化學(xué)試劑廠）、液相用試劑為色譜純（美國(guó)Fisher scintific）。

1.2 藥 材 實(shí)驗(yàn)所需何首烏來(lái)自陜西省藥材市場(chǎng)，產(chǎn)自四川。經(jīng)鑒定為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根。按照2010版《中國(guó)藥典》和《本草綱目》的方法炮制何首烏。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 何首烏水提物的制備 取何首烏生品及不同炮制品飲片各30g，煎煮提取，第1次加8倍量水，提取1h，傾出提取液，殘?jiān)偌?倍量的水，提取1h，合并2次提取液，水浴蒸干，真空干燥，即得，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 何首烏水提物供試溶液的制備 取何首烏生品及不同炮制品水提物粉末0.2g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)重（準(zhǔn)確至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為測(cè)定游離型蒽醌的供試品溶液。

2.3 何首烏醇提物供試溶液的制備 取何首烏生品及不同炮制品細(xì)粉（過(guò)4號(hào)篩）0.5g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱(chēng)重（準(zhǔn)確至0.001g），水浴回流1h，取出，放冷，稱(chēng)重，用甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，取續(xù)濾液作為測(cè)定游離型蒽醌的供試品溶液。

2.4 對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱(chēng)取大黃素、大黃酚和大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇分別配成質(zhì)量濃度為0.0605mg／mL的大黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液、0.0644mg／mL的大黃酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.0996mg／mL大黃酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.5 色譜分析條件 參照高效液相色譜法（附錄ⅥD）測(cè)定，色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，Diamosil（4.6×250mm，5μm、NO：6004988）；以甲醇-0.1%磷酸（85：15）為流動(dòng)相；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：室溫，進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于3000。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系的考察：分別精密量取貯備液2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以大黃素對(duì)照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程得：y＝4E＋06x－15524（R2＝0.9997）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大黃素線性關(guān)系考察

結(jié)果表明：在0.121～0.726μg范圍內(nèi)，大黃素峰面積y與進(jìn)樣量x（μg）線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn)：精密吸取樣品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定大黃素峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度結(jié)果

結(jié)果表明：精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取何首烏生品供試品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定大黃素峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果

結(jié)果表明：供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)：按擬定的含量測(cè)定條件及方法，取同一批號(hào)樣品供試液，平行稱(chēng)取6份進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性結(jié)果

結(jié)果表明：重復(fù)性良好。

3 樣品測(cè)定

分別取何首烏生品及不同炮制品水提物樣品和何首烏生品及不同炮制品粉末，按“何首烏水提物供試溶液的制備”方法和“何首烏醇提物供試溶液的制備”方法制備供試溶液。按上述色譜條件，10μL注入色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算何首烏生品及不同炮制品水提物和醇提物中游離蒽醌的含量。結(jié)果：樣品中未檢測(cè)出大黃酸與大黃酚。見(jiàn)表5，圖1-7。

表5 何首烏生品及不同炮制品大黃素含量測(cè)定結(jié)果

圖1 大黃素標(biāo)品HPLC圖譜

圖2 大黃酸標(biāo)品HPLC圖譜

圖3 大黃酚標(biāo)品HPLC圖譜

圖4 何首烏生品水提物HPLC圖譜

圖5 何首烏生品醇提物HPLC圖譜

圖6 何首烏九蒸九曬水提物HPLC圖譜

圖7 何首烏九蒸九曬醇提物HPLC圖譜

4 結(jié) 果

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法檢測(cè)何首烏生品及不同炮制品中大黃素含量，結(jié)果顯示：何首烏生品及不同炮制品水提物與醇提物中均含有大黃素，其水提物中清蒸何首烏大黃素含量最高，九蒸九曬何首烏含量最低，醇提物中生品何首烏大黃素含量最高，九蒸九曬何首烏大黃素含量最低。所有樣品未能檢測(cè)出大黃酸與大黃酚。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：九蒸九曬之何首烏蒸制時(shí)間較長(zhǎng)，大黃素含量最低；而現(xiàn)代清蒸、黑豆汁制法時(shí)間較短，因而大黃素含量較高；而何首烏生品未經(jīng)系統(tǒng)炮制，大黃素含量最高。

5 討 論

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，蒽醌類(lèi)成分可能為何首烏中導(dǎo)致藥物性肝臟損傷的主要毒性成分[3]。衛(wèi)培峰等[4]在何首烏不同成分與肝細(xì)胞凋亡相關(guān)性研究中，將何首烏中蒽醌類(lèi)成分提取物以及制首烏分別按不同劑量給予大鼠每天灌胃1次，連續(xù)3個(gè)月，檢測(cè)大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，給藥組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高。胡錫琴等[5]通過(guò)制何首烏對(duì)大鼠的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給藥組對(duì)大鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶AST、ALT、ALP在不同階段均有一定的影響，對(duì)大鼠肝臟有一定的毒副作用，但屬于可逆轉(zhuǎn)損傷。譚凱麗等[6]通過(guò)文獻(xiàn)再評(píng)價(jià)認(rèn)為，何首烏代謝產(chǎn)物可引起肝細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化致肝細(xì)胞壞死。而大黃素則為蒽醌類(lèi)主要成分之一，因此根據(jù)大黃素含量測(cè)定結(jié)果可以推測(cè)，何首烏生品導(dǎo)致肝損傷的風(fēng)險(xiǎn)最高，而九蒸九曬組最低。而古代本草文獻(xiàn)之所以未記載有關(guān)制首烏導(dǎo)致藥物性肝損傷病例的發(fā)生，很可能與使用九蒸九曬后蒽醌類(lèi)成分大幅度降低有關(guān)。

[1]俞 捷，謝 潔，趙榮華，等.何首烏肝臟不良反應(yīng)研究進(jìn)展[J].中草藥，2010，41（7）：1206-1210.

[2]孫桂波，紀(jì)鳳蘭，徐惠波，等.何首烏的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23（4）：105-106.

[3]方紅玫，朱廷焱.何首烏有效成分、毒性作用和相關(guān)研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2010，37（4）：283.

[4]衛(wèi)培峰，黨艷麗，焦晨莉，等.何首烏不同成分與肝細(xì)胞凋亡的相關(guān)性研究[J].陜西中醫(yī)，2009，30（2）：238-239.

[5]胡錫琴，楊曉青，邢玉瑞，等.制何首烏致肝損害的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī)，2006，27（5）：625-626.

[6]譚凱麗，廖海民.何首烏的藥理作用研究進(jìn)展[J].山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2010，29（1）：72-75.