益氣活血方對早期DN大鼠腎臟TGF-β1／Smads表達的實驗研究＊

蘇衍進 王郁金 馬居里 雷根平 林 源 陜西中醫(yī)學院（咸陽 712046）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥之一。糖尿病（diabetes mellitus，DM）病程10年以上者約50%并發(fā)DN，在每年新增終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）中，DN所占比例逐年升高?，F(xiàn)代醫(yī)學治療糖尿病腎病療效較差，而中醫(yī)藥多靶點治療療效越來越顯著。故目前中醫(yī)藥在糖尿病腎病方面研究成為當前研究的熱點。

導師馬居里教授長期從事糖尿病腎病臨床及科研工作，認為該病病機多端，但其關鍵在于氣虛血瘀，“氣虛”是本，“血瘀”是標，本虛標實，故氣虛血瘀是本病的根本病機，瘀阻腎絡則是糖尿病腎病的病理核心。根據(jù)上述病機，自擬益氣活血方[1]治療多例患者，臨床療效較好，為進一步探討其作用機理，本課題通過動物實驗，從藥效和機理方面對自擬益氣活血方治療早期DN進行研究。具體研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 自擬益氣活血方組成：黃芪30g，丹參20g，蒼術、生薏苡仁各12g，當歸、玄參、川樸各10g。購自陜西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中藥房。鹽酸貝那普利片（洛汀新）：規(guī)格10mg／片；批號：H20030514。由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 動 物 SD雄性大鼠共計82只，7周齡，體重200.46±13.95克／只。西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.3 試 劑 鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司），尿微量白蛋白ELTSA試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗大鼠Smad2多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗大鼠Smad7多克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.4 儀 器 日立全自動生化分析儀（日本日立公司），JB-L6組織包埋系統(tǒng)（武漢俊杰電子有限公司），圖像采集系統(tǒng)（NIKON.ACT-1DXM1200），日本尼康公司 Bio-Tek ELX808吸收光酶標儀（美國伯騰儀器有限公司），BK1301生物顯微鏡（重慶光學儀器廠）。

1.5 方 法 大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成兩大組，即A組（正常對照組10只），另72只大鼠依據(jù)文獻復制模型[2]，成功造模后死亡3只，剩余69只，將造模成功大鼠隨機分為糖尿病腎病模型組（12只）、貝納普利組（12只）、自擬益氣活血方小劑量組（15只）、自擬益氣活血方中劑量組（15只）、自擬益氣活血方大劑量組（15只）。中藥大劑量組予以劑量22.6g／kg·d；中劑量組給予11.3g／kg·d灌胃，小劑量組大鼠給予5.65g／kg·d灌胃；貝那普利組予以1.04mg／kg·d灌胃。正常對照組以同樣的方法，予以等量生理鹽水。造模成功后1周開始給藥，每天上午給藥1次，不間斷給藥11周。整個實驗期間，沒有使用胰島素及其它降糖。所有大鼠分別于0、6、12周末測24h尿量并保存，以備檢測尿微量白蛋白（用ELISA檢測）。第12周取腎皮質(zhì)組織行HE染色、Masson染色步驟，采用酶免疫組織化學SP二步法檢測腎組織中TGF-β1、Smad2、Smad7表達。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示（），采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析，多組間比較用單因素方差分析，兩組間差異采用LSD法進行組間差異顯著性檢驗，方差不齊者采用Tamhane，sT2檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01差異有顯著性統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠24h尿微量白蛋白定量變化 糖尿病腎病組與正常組尿微量白蛋白定量比較，第6周、第12周有統(tǒng)計學差異，貝納普利組及自擬益氣活血方各組與糖尿病腎病組比較有統(tǒng)計學差異。自擬益氣活血方大劑量組較中小劑量組比較有統(tǒng)計學差異。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠24h尿微量白蛋白定量變化比較（mg／24h，）

表1 各組大鼠24h尿微量白蛋白定量變化比較（mg／24h，）

注：與正常對照組相比◇P＜0.05，◆P＜0.01；與自擬益氣活血方（5.65mg／kg）組相比△P＜0.05，▲P＜0.01

組 別 劑量（mg／kg） n 0周 6周 12周10 1.47±0.68 1.32±0.81 1.74±0.46糖尿病腎病模型 ／ 12 1.36±0.71 16.57±5.86◇ 33.47±10.51◇貝納普利 1.04 12 1.41±0.69 14.99±4.30 20.76±4.76自擬益氣活血方 5.65 15 1.39±0.38 14.27±5.30 18.39±4.91自擬益氣活血方 11.30 15 1.32±0.35△ 14.89±4.27△ 17.56±3.52△自擬益氣活血方 22.60 15 1.35±0.46▲◆ 13.76±3.32▲◆ 13.45±4.38正常對照 ／▲◆

2.2 12周末各組大鼠腎臟 TGF-β1、Smad2、Smad7表達貝納普利組、自擬益氣活血方小劑量組與糖尿病腎病組比較，腎皮質(zhì)TGF－β1、Smad2表達明顯下降，Smad7表達明顯升高；且大劑量較中小劑量組效果更好。結(jié)果見表2。

表2 12周末各組大鼠腎臟TGF-β1、Smad2、Smad7表達比較（）

表2 12周末各組大鼠腎臟TGF-β1、Smad2、Smad7表達比較（）

注：與糖尿病腎病組比較△P＜0.05，▲P＜0.01；與自擬益氣活血方小劑量組比較◇P＜0.05，◆P＜0.01

Smad2 Smad7正常對照 ／ 10 2.00±1.05▲ 2.10±0.99▲ 5.86±1.03組 別 劑量（mg／kg） n TGF-β1▲糖尿病腎病模型 ／ 12 5.85±1.14 6.58±1.24 2.08±0.79貝納普利 1.04 12 4.16±1.21△ 4.23±1.69△ 3.84±1.68△自擬益氣活血方 5.65 15 4.09±1.42△ 4.04±1.71△ 3.92±1.55△自擬益氣活血方 11.30 15 3.65±1.36◇ 3.25±1.56◇ 4.28±1.24◇自擬益氣活血方 22.60 15 2.64±0.82◆ 2.98±1.36◆ 5.34±1.36◆

3 結(jié) 論

自擬益氣活血方能夠減少早期糖尿病腎病24小時尿微量白蛋白排泄。

自擬益氣活血方能減少早期DN模型大鼠腎組織TGF－β1、Smad2的表達，上調(diào)Smad7的表達，繼之延緩腎臟纖維化，延緩DN的進展，且大劑量組較中小劑量組效果更好。

4 討 論

糖尿病腎病（DN）是糖尿病（DM）最重要和最常見的并發(fā)癥之一，在終末期腎衰竭患者中約三分之一是由DN引起的，DN成為糖尿病病人的主要死亡原因之一。其發(fā)生機制較為復雜，研究表明細胞因子是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展重要因素之一；諸多細胞因子中以促進腎臟細胞發(fā)生細胞肥大、增加系膜細胞細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的TGF-β1為核心因子，是DN發(fā)病機制的最后共同通路[3，4]。此外，研究表明Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受體胞內(nèi)激酶底物，介導TGF-β的胞內(nèi)信號傳導過程[5]，而 Smads[6－8]有9種，其中主要以 Smad2、Smad7參與TGF-β1信號轉(zhuǎn)導。

DN屬“消渴”、“消腎”等范疇，本質(zhì)是“本虛標實，虛實夾雜”之證，是消渴病氣陰兩虛的發(fā)展。消渴病，早期陰虛為本，燥熱為標，漸病久陰虛及氣，而成氣陰兩虛之證，中期燥熱漸減，氣虛而運血無力，陰虛繼而血行艱澀，血液運行不暢則瘀阻經(jīng)脈，形成氣虛血瘀證候?！皻馓撗佟必灤┯贒N發(fā)展的全過程，導師馬居里教授根據(jù)此病機以益氣活血為則，自擬益氣活血方治療多例糖尿病腎病患者獲較好療效。現(xiàn)代藥理研究表明：黃芪能有效降低血小板活化程度，降低血小板的聚集性，減少血栓形成，改善血液高凝狀態(tài)。丹參可以通過擴張血管、加快血液流速，從而消除血液淤滯改善微循環(huán)，達到“血行則水行”，當歸有降低血脂、抑制大鼠血小板聚集、抑制小鼠血小板炎性物質(zhì)的釋放等作用。蒼術，增加小鼠血清中的超氧化物歧化酶（SOD）的含量。玄參，能顯著競爭性抑制醛糖還原酶的活性，使高血糖條件下多元醇的代謝過程受到抑制，從而減少了山梨醇在在腎組織的聚集延緩DN的發(fā)展。川樸，具有抑制血小板凝集的作用，降低膽固醇作用。

本研究表明，24h尿微量白蛋白定量，大、中、小中藥劑量組較糖尿病腎病模型組明顯下降，且中藥大劑量組較中、小劑量組療效更好，中小劑量組之間無顯著性差異，大劑量組與貝納普利組比較有顯著性差異（P＜0.05），第6周中藥各組及貝那普利組之間無顯著性差異（P＞0.05）；酶免疫組化結(jié)果顯示，大、中、小中藥組與貝那普利組TGF－β1、Smad2在腎臟表達均低于模型組（P＜0.05），且大劑量中藥組與貝那普利組比較有顯著性差異；大、中、小中藥組與貝那普利組Smad7在腎臟的表達均高于模型組（P＜0.05），且大劑量中藥組與貝那普利組之間有顯著性差異（P＜0.05），中藥中劑量與小劑量組之間無顯著性差異（P＞0.05）。

綜上所述，自擬“益氣活血方”對糖尿病腎病治療作用機制可能為：①改善腎臟微循環(huán)、增加腎血流量，降低血液粘稠度，改善腎小球基底膜通透性，進而對腎小球基底膜電荷屏障及機械屏障有保護作用，從而使尿中微量白蛋白減少。②調(diào)節(jié)細胞因子 TGF－β1、Smad2、Smad7表達，繼之抑制 TGF－β1／Smads信號轉(zhuǎn)導通路的激活，達到延緩腎小球纖維化、硬化，有效保護腎臟。

[1]蘇衍進，王惠玲，王郁金.糖腎Ⅰ號膠囊治療早期糖尿病腎病30例[J].中醫(yī)雜志，2010，51（12）：1106-1107.

[2]胡怡秀.糖尿病腎病動物模型研究進展[J].國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊，2008，35（6）：338-342.

[3]Ziyadeh FN.Mediators of diabetic renal disease：the case of tgf-Beta as the major mediator[J].Journal of the Ameri-can of Society of NePhorlogy，2004，15SuPP11：S55-7.

[4]劉志紅，黎磊石.糖尿病腎病發(fā)病機理[J].中華腎臟病雜志，1999，15（2）：120-123.

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[6]DerynckR，ZhangY，F(xiàn)engXH.Smads：Transcriptional activators of TGF-betaresponses[J].Ce11，1998，95：737-740.

[7]PiekE，HeldinCH，DijkePT.Specificity，diversity，and regulation in TGF-βsuperfamily signaling[J].FASEB J，1999，13：2105-2124.

[8]Heldin CH，Miyazono K，Dijke P.TGF-beta signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins[J].Nature，1997，390：465-471.