電針對坐骨神經(jīng)損傷大耳白兔脊髓前角組織中GAP-43的影響＊

王瑞輝 張秋紅 屈紅艷 杜 旭 陜西中醫(yī)學院（咸陽 712046）

周圍神經(jīng)損傷是很常見的創(chuàng)傷性疾患，指周圍神經(jīng)叢、神經(jīng)干或其分支受到外力作用，如銳器傷、牽拉傷、擠壓傷等而發(fā)生的損傷。在人類的生活、勞動過程中均能發(fā)生，尤其是隨著現(xiàn)代工業(yè)、交通運輸業(yè)的迅猛發(fā)展，工傷和交通事故造成的周圍神經(jīng)損傷，包括坐骨神經(jīng)及其分支損傷，發(fā)病率逐年升高，已成為常見病之一。顯微外科的發(fā)展使周圍神經(jīng)損傷的手術修復明顯提升，但解剖上的修復還不能完全解決患者的功能的恢復，一些患者遺留有感覺、運動功能障礙，嚴重影響工作和生活質量。臨床針灸治療能促明顯進功能的恢復，但其治療的機理還不是完全清楚，本實驗通過動物實驗觀察電針治療對坐骨神經(jīng)損傷大耳白兔脊髓腰膨大組織中GAP-43含量的影響，以探索電針治療本病的部分機理，為針灸治療周圍神經(jīng)損傷提供實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用健康成年雄性大耳白兔48只，體重2±0.2kg，動物合格證號：SCXK（陜）2007-002。

1.2 主要試劑 兔抗兔GAP-43多抗（克隆號BA0878，武漢博士德生物工程技有限公司）；SABC免疫組化試劑盒（型號SA1022，武漢博士德生物工程有限公司）；DAB顯色劑（型號AR1022，武漢博士德生物工程有限公司）

1.3 動物分組及造模 將購回的48只大耳白兔適應性喂養(yǎng)1周，按照體重從小到大排列，隨機分為空白對照組、模型對照組、電針治療組，每組16只。模型對照組和電針治療組參照文獻[1]造模，用螺旋測微儀卡口擠壓坐骨神經(jīng)，夾至0.15mm處保持60s，松開30s，再夾至0.15mm處保持60s（預實驗中經(jīng)病理切片HE染色證實造成坐骨神經(jīng)SunderlandⅡ～Ⅲ度損傷），并于術后7d內(nèi)，在動物下肢肌肉注射青霉素40萬u，1d2次，進行抗感染處理。

1.4 處理方法 空白對照組：在室溫20～25℃動物房內(nèi)，讓動物自由飲水及飲食，不做任何處理；模型對照組：造模成功后，與空白對照組相同條件下喂養(yǎng)，并模擬捉拿，但不施加電針治療；電針治療組：造模成功后，與空白對照組相同條件下喂養(yǎng)，并于造模后第2天實施電針治療，選取相當于人體的“環(huán)跳”、“足三里”兩個穴位，參考文獻[2]定位，常規(guī)酒精消毒，選用32號的1寸毫針刺入，連接G6805-C治療儀，選用疏密波，強度以針身微抖動為度，留針20min。1d1次，7d為1療程，休息1d，開始下1療程，共治療2個療程。分別于第1療程與第2療程結束后當天麻醉動物并取材備用。

1.5 觀察指標與檢測方法 GAP-43測定：在第1、2療程結束后當日，每組各取大耳白兔8只，以造模同樣方法麻醉后，剝除脊髓被膜取長度約為1cm的脊髓腰膨大段組織。所取組織置入4%中性甲醛溶液中，室溫固定24h，第2日轉入PBS緩沖液中待用。分批次進行脫水、浸蠟、石蠟包埋組織，以4um為厚度縱切組織，方法如下：①切片常規(guī)脫蠟至水：二甲苯Ⅰ5～10min→二甲苯Ⅱ5～10min→無水乙醇I 3～5min→無水乙醇II 3～5min→95%酒精3～5min→85%酒精3～5min→蒸餾水中浸泡3min。②熱修復抗原：將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），電爐加熱至95℃后斷電，間隔10min，反復2次。冷卻后PBS（pH7.2～7.6）洗滌2min×2次。③30%H2O220mL以蒸餾水10倍稀釋至3%H2O2200mL，室溫10min以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水2min×3次。⑤滴加抗體稀釋液1∶100稀釋的兔多克隆抗兔GAP-43，4℃過夜，后于37℃溫箱復溫30min。PBS（pH7.2～7.6）洗2min×2次。⑥滴加生物素化山羊抗兔IgG37℃1h。PBS洗2min×3次。⑦滴加試劑SABC，37℃20min。PBS（pH7.2～7.6）洗5min×4次。⑧DAB顯色：取1mL蒸餾水，加DAB顯色試劑盒中A，B，C試劑各加一滴，混勻后加至切片。室溫顯色，鏡下控制反應時間，10～30min后蒸餾水洗滌終止反應。⑨蘇木素中復染3～5s，水洗，鏡下控制復染顏色。脫水，透明，中性樹膠封片。⑩光鏡下觀察脊髓前角陽性細胞數(shù)，每只動物取3張切片觀察，取其平均數(shù)作為該動物的陽性細胞數(shù)。

2 結 果

2.1 電針治療1、2療程后GAP-43表達的影響的檢測結果見下表。

表1 第1和第2療程結束后各組相應脊髓節(jié)段GAP-43陽性細胞數(shù)比較（個，）

表1 第1和第2療程結束后各組相應脊髓節(jié)段GAP-43陽性細胞數(shù)比較（個，）

注：與空白對照組比較，◇表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.01

第一療程后 第二療程后空白對照組組 別 n 8 0.00±0.00 0.00±0.00模型對照組 8 16.83±2.06◇ 6.37±1.41◇電針治療組 8 24.16±1.78△ 13.55±1.66△

從上表中可以看出，第1、2個療程后，模型對照組脊髓中GAP-43陽性細胞表達數(shù)均高于空白對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01），說明大耳白兔坐骨神經(jīng)急性損傷后脊髓相應節(jié)段中的GAP-43表達增加；電針治療組脊髓中GAP-43含量高于模型對照組，差異有顯著性意義（P＜0.01），說明使用電針治療能增強脊髓相應節(jié)段中GAP-43的表達水平。

各組實驗切片檢測顯示空白對照組在第1和第2療程結束后GAP-43無明顯表達；而模型組和電針治療組在第1和第2療程結束后GAP-43均有明顯表達，而且以電針組表達更為顯著（見圖1～5）。

3 討 論

坐骨神經(jīng)損傷臨床癥狀與中醫(yī)“痿證”的表現(xiàn)相似。早在《內(nèi)經(jīng)》中就已經(jīng)有了“治痿獨取陽明”的記載。本實驗選取“足三里”以調其陽明經(jīng)之氣血，環(huán)跳穴屬足少陽膽經(jīng)穴，是膽經(jīng)與足太陽膀胱經(jīng)交會穴，用之可疏通經(jīng)絡、行氣活血，是治療下肢痿痹的要穴。兩穴配合使用，可疏經(jīng)活絡，補益氣血，改善肌肉營養(yǎng)，促進神經(jīng)功能恢復。

GAP-43是一種分子量為24KD的鈣調蛋白結合的胞膜磷酸蛋白質。80年代初由Skene等[3]人首先從兔再生的外周神經(jīng)中獲得，被認為是神經(jīng)元再生和發(fā)育的一個內(nèi)在決定因子。GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育、再生、修復和突觸可塑性中起著重要作用，GAP-43可能是在神經(jīng)元生長過程中靠改變生長錐中的G蛋白活性，影響軸突生長。如果生長錐中的G蛋白與其受體反應產(chǎn)生抑制信號，就會導致生長錐停止生長。而GAP-43與生長錐中的G蛋白結合后，這種抑制信號被解除，軸突就會繼續(xù)生長[4]。目前尚不清楚GAP-43表達的調控機制，推測其表達可能與轉錄后的調節(jié)密切相關。

周圍神經(jīng)損傷后，GAP-43含量可增加20～100倍[5，6]，國際上已將其列為研究神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復等的首選分子探針。增強損傷脊髓或神經(jīng)組織中GAP-43的表達水平，能促進損傷組織中神經(jīng)元的再生和修復，對損傷組織起保護作用。張奇蘭[7]等研究發(fā)現(xiàn)GAP-43在脊髓損傷后24h即開始陽性表達，5～7d時達高峰，損傷后2周開始下調，提示GAP-43參與脊髓損傷后神經(jīng)的再生修復與功能的恢復。

本課題研究結果發(fā)現(xiàn)，在大耳白兔坐骨神經(jīng)急性損傷后，模型對照組其脊髓腰膨大中GAP-43，7d時表達水平較高，14d時逐漸降低；而電針治療組GAP-43水平，7d時表達較模型對照組高，14d時仍保持在較高水平。說明電針能增強坐骨神經(jīng)損傷后脊髓相應節(jié)段組織中GAP-43的表達。這也許是因為電針通過刺激促使神經(jīng)元胞體合成更多的GAP-43，以結合到更多的G蛋白反應位點，促進生長錐延伸和軸突快速生長，從而促進損傷神經(jīng)的修復和再生。

[1]屈紅艷，王瑞輝，劉飛虎.電針對家兔坐骨神經(jīng)損傷后IL-1β的影響[J].陜西中醫(yī)，2007，28（4）：506.

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[7]張奇蘭，李俊岑，丁培培，等.神經(jīng)生長相關蛋白GAP-43在脊髓損傷后不同時段的表達[J].四川解剖學雜志，2010，18（2）：1-3.