麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)大鼠心肌細(xì)胞鈣離子濃度和細(xì)胞膜鈣通道的影響

侯平，楊麗，劉寧，陳磊

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)二科，沈陽 110032；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 110847；3.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 110001）

《傷寒論》第301條“少陰病，始得之，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃細(xì)辛附子湯主之”主張心動(dòng)過緩癥以麻黃細(xì)辛附子湯治療。大量臨床觀察證明麻黃細(xì)辛附子湯對(duì)慢性心動(dòng)過緩癥狀有改善作用［1～3］，但其配伍的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)作用機(jī)制尚不明確?？剐穆墒СＫ幬锏幕倦娚碜饔檬怯绊懶募〖?xì)胞膜的離子通道，通過改變離子流而改變細(xì)胞的電生理特性。因此本研究通過考察麻黃細(xì)辛附子的3種活性單體麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)大鼠心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和高電壓依賴性鈣通道電流的影響，從中藥有效單體對(duì)鈣離子流影響的角度闡明麻黃細(xì)辛附子配伍的合理性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

健康大鼠由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［合格證號(hào)為SCXK（遼）2010-0001］，體質(zhì)量250～300 g，雌雄不拘。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作均符合遼寧中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物保護(hù)條例。主要試劑有麻黃堿（南京澤朗醫(yī)藥科技公司，98.0%）、β-細(xì)辛醚（Sigma，批號(hào)03124JRV，70%）、去甲烏藥堿（南京澤朗醫(yī)藥科技公司，98.0%）、膠原酶V（美國Sigma公司）。

1.2 儀器

激光掃描共聚焦顯微鏡（FV1000S-SIM/IX81，日本 OLYMPUS 公 司 ）、P-97 Flaming/Brown Micropipetter Puller（美國Sutter instrument公司）、MultiClamp700B（美國Axon公司）、pClamp10.0數(shù)據(jù)分析軟件（美國Axon公司）、玻璃電極拋光器（MF-9，Narishige會(huì)社）、CF7D2型離心機(jī)（Hitachi Himac會(huì)社）等。

1.3 急性心室肌細(xì)胞的單離

正 常 臺(tái) 氏 液 （mmol/L）：NaCl 143，KCl 5.4，NaH2PO40.30，HEPES 5，葡萄糖 5.5，MgCl20.5，CaCl21.8，以NaOH調(diào)pH 7.4。低鈣臺(tái)氏液：鈣離子濃度為 20～70 μmol/L 的臺(tái)式液。Kraftbrune（KB）液（mmol/L）：KOH 70，谷氨酸 50，KCl 40，KH2PO420，牛磺酸 20，MgCl23，葡萄糖 10，HEPES 10，EGTA 0.5，以HCl調(diào)pH 7.4。動(dòng)物麻醉后迅速開胸取出心臟，置于4℃預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液中沖洗，剪開心包，經(jīng)主動(dòng)脈插管懸掛于改良的Langendorff灌流裝置上，依次用正常臺(tái)氏液、低鈣臺(tái)氏液經(jīng)主動(dòng)脈根部逆行灌流，當(dāng)心臟跳動(dòng)完全停止時(shí)，改用含膠原酶V（0.3 mg/mL）的臺(tái)氏液消化20～30 min，再以KB液灌流，除去膠原酶后，將心室取下在KB中緩慢吹打分離，過濾離心后，將心室肌細(xì)胞置于KB液中穩(wěn)定冷藏保存，4～8 h內(nèi)使用。整個(gè)灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有液體均用氧氣飽和。

1.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化的測(cè)定［4］

1.4.1 熒光探針標(biāo)記：將急性單離心室肌細(xì)胞接種于經(jīng)0.01%多聚賴氨酸包被的激光共聚焦測(cè)鈣專用NEST細(xì)胞培養(yǎng)皿上靜止30 min。待細(xì)胞完全貼壁后移去培養(yǎng)皿內(nèi)液體，將198 μL正常臺(tái)氏液和2 μLCa2+熒光探針染料Fluo-3/AM（終濃度為5μmol/L）混勻后加入培養(yǎng)皿小室中，37℃孵箱避光孵育45 min，使Fluo-3/AM與鈣離子充分結(jié)合。測(cè)定前用正常臺(tái)氏液清洗3次，加入200 μL含鈣或無鈣臺(tái)氏液待測(cè)。將培養(yǎng)皿置于激光掃描共聚焦顯微鏡載物臺(tái)上，在光鏡下找到形態(tài)完整、橫紋清晰的細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行掃描（頻率為0.2 Hz）。

1.4.2 鈣離子濃度變化測(cè)定：Fluo-3/AM被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后，被酯酶水解釋出Fluo-3，F(xiàn)luo-3與Ca2+絡(luò)合，在488 nm處的激光激發(fā)而產(chǎn)生熒光，其熒光值與鈣離子濃度呈正相關(guān)，即以熒光值變化表示鈣離子濃度變化，以平均熒光強(qiáng)度代表鈣離子濃度。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)526 nm。先測(cè)定靜息狀態(tài)下給藥前鈣離子濃度作為對(duì)照，再加入相應(yīng)濃度的試藥麻黃堿、β-細(xì)辛醚或去甲烏藥堿，觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的動(dòng)態(tài)變化情況，測(cè)定給藥后鈣離子濃度。

1.5 膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)

根據(jù)Hamill等［5］方法進(jìn)行全細(xì)胞膜片鉗記錄實(shí)驗(yàn)。吸幾滴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞池中，置于倒置顯微鏡（IMT-2，Olympus）工作臺(tái)上，放置 10 min 左右，待細(xì)胞貼壁后用臺(tái)氏液持續(xù)灌流，流速為3 mL/min，溫度保持在（25±2）℃，選擇表面光潔、橫紋清楚的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將玻璃電極輕壓在細(xì)胞表面，用負(fù)壓使電極尖端與細(xì)胞膜表面形成GΩ高阻封接后，再以較大負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，補(bǔ)償電容電流及電極串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞記錄。記錄信號(hào)經(jīng)Ag-AgCl電極引導(dǎo)，電流經(jīng)放大器（MultiClamp 700B）放大，再經(jīng)Digidata 1440進(jìn)行A-D轉(zhuǎn)換采集數(shù)據(jù)，由pClamp10.0軟件處理和分析。用P-97電極拉制器將玻璃微電極拉制后，經(jīng)拋光器拋光，充灌電極內(nèi)液后尖端阻抗為5～10 MΩ。電極內(nèi)液組成為（mmol/L）CsCl 130，HEPES 5，MgCl21，K2ATP 5，CPK 5，EGTA 1，CsOH調(diào)pH至7.2。細(xì)胞外灌流液為正常臺(tái)氏液。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Clamp10.0系統(tǒng)處理，經(jīng)SPSS 15.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

經(jīng)初步量效關(guān)系篩查，確定濃度為2 μmol/L的麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有顯著影響且沒有毒性作用，因此本研究中統(tǒng)一使用此濃度。Fluo-3/AM熒光探針法細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定結(jié)果表明，2 μmol/L麻黃堿可使單離大鼠心肌細(xì)胞鈣離子濃度顯著升高至（122.99±6.93）%，與給藥前（100%）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而 2 μmol/L β-細(xì)辛醚和 2 μmol/L 去甲烏藥堿則使鈣離子濃度下降，分別為（83.38±1.30）%和（89.83±2.11）%，與給藥前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

為了明確麻黃堿對(duì)鈣離子濃度的升高作用是否與細(xì)胞外鈣離子通過鈣通道內(nèi)流有關(guān)，采用細(xì)胞外液鈣離子濃度為零溶液測(cè)定鈣離子濃度。此時(shí)若麻黃堿給藥后的鈣離子濃度升高作用受到抑制，則表明該作用與細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明，在細(xì)胞外鈣離子濃度為零的條件下，與給藥前比較，2 μmol/L麻黃堿沒有使鈣離子濃度顯著升高（103.33±2.19%），說明麻黃堿的升高鈣離子濃度作用與促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子通過鈣離子通道內(nèi)流有關(guān)。

2.2 麻黃堿、β細(xì)辛醚和去甲烏藥堿對(duì)高電壓依賴性鈣離子通道電流的影響

為了確定高電壓依賴性鈣離子通道在3種單體對(duì)鈣離子流動(dòng)影響中的貢獻(xiàn)，采用全細(xì)胞電壓鉗法測(cè)定心肌細(xì)胞高電壓依賴性鈣離子通道的鈣電流（ICa）。設(shè)定保持電位-40 mV，指令電壓為-50～+50 mV，步階電壓10 mV，刺激頻率為2 Hz，刺激間隔為6 s，記錄ICa。為消除細(xì)胞間誤差，電流值以電流密度（pA/pF）表示。與給藥前比較，2 μmol/L麻黃堿顯著提高了心肌細(xì)胞ICa峰電流密度值（P<0.05），見圖1、表 1；而 2 μmol/L β-細(xì)辛醚和 2 μmol/L 去甲烏藥堿給藥后分別與給藥前比較略有下降，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 2 μmol/L麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿給藥前后ICa峰電流密度變化比較Tab.1 Changes of peak current density ICabefore and after administration of 2 μmol/L ephedrine，β-asarone and higenamine

3 討論

中藥麻黃的有效成分麻黃堿是一種腎上腺素能受體激動(dòng)劑，既能促進(jìn)去甲腎上腺素神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素，又能直接作用于腎上腺素受體發(fā)揮擬腎上腺素作用。麻黃堿可激動(dòng)β1受體使心肌收縮力增強(qiáng)，心輸出量增加，心率加快。本研究初步篩查了麻黃堿、β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿分別對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子流的影響，結(jié)果表明麻黃堿可使通過高電壓依賴性鈣通道電流密度增加，與鈣離子濃度變化呈相同趨勢(shì)，說明麻黃堿對(duì)鈣離子流動(dòng)的影響在于促進(jìn)細(xì)胞膜電壓依賴性的鈣通道開放，鈣離子大量流入細(xì)胞內(nèi)，從而使鈣離子濃度升高，可興奮心肌細(xì)胞，但也可能造成心肌細(xì)胞過度興奮而導(dǎo)致心律失常。

β-細(xì)辛醚使通過高電壓依賴性鈣通道的電流密度稍有減弱，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度顯著下降，與其在皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞的作用基本相同［6］，表明β-細(xì)辛醚有一定的鈣通道阻滯作用而使冠脈血管擴(kuò)張［7］。研究證明去甲烏藥堿能輕微上調(diào)β-腎上腺素受體［8］，提高竇房結(jié)自律性和改善房室傳導(dǎo)，具有強(qiáng)心和提高心率作用［9］。因此，β-細(xì)辛醚與去甲烏藥堿有改善心肌血供和增加心輸出量的作用。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿均輕微降低鈣內(nèi)流，減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)β-細(xì)辛醚和去甲烏藥堿可對(duì)受損傷的心肌細(xì)胞有保護(hù)作用［10，11］。

綜上所述，麻黃細(xì)辛附子三味中藥的活性單體中，麻黃堿能升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度和促進(jìn)高電壓依賴性鈣離子內(nèi)流，對(duì)心肌細(xì)胞有興奮作用；β-細(xì)辛醚、去甲烏藥堿能降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，使心肌細(xì)胞免受鈣超載損傷而具有保護(hù)作用。3種單體對(duì)心肌細(xì)胞鈣離子影響作用可相互補(bǔ)償控制，符合中藥方劑學(xué)相反相成配伍理論，提示麻黃細(xì)辛附子湯既有興奮心肌細(xì)胞的作用成分又有可控制由心肌細(xì)胞興奮所產(chǎn)生的心律失常的成分，可能因此具有綜合調(diào)控心率的作用。3種單體對(duì)心肌細(xì)胞功能影響的直接相互作用關(guān)系及其機(jī)制將進(jìn)一步研究。

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