糖皮質(zhì)激素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響

何舒翹,錢(qián) 旭,張貴平,張維文,張 梅

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣州 廣東 511436)

糖皮質(zhì)激素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響

何舒翹,錢(qián) 旭,張貴平,張維文,張 梅

(廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，廣州 廣東 511436)

目的 觀察糖皮質(zhì)激素對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響并初步探討其機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2，使用Fluo3-AM作為鈣熒光染料，激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)掃描觀察氫化可的松處理后BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的動(dòng)態(tài)變化情況。結(jié)果 氫化可的松和陽(yáng)性對(duì)照藥尼古丁均能顯著升高BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣水平(P<0.05)；實(shí)時(shí)掃描顯示氫化可的松即刻引起細(xì)胞內(nèi)鈣升高，15 s左右達(dá)到峰值，持續(xù)約10 s后開(kāi)始下降，200 s左右恢復(fù)至基態(tài)，并且這一作用顯示出與尼古丁升高細(xì)胞內(nèi)鈣效應(yīng)的一致性。糖皮質(zhì)激素受體拮抗劑RU486不能取消氫化可的松升高BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)(P>0.05)；而α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7nAChR)阻斷劑甲基牛扁亭堿(MLA)可以拮抗氫化可的松升高BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論 氫化可的松通過(guò)影響α7nAChR升高小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣水平，這一作用不但證實(shí)了糖皮質(zhì)激素的非基因組效應(yīng)，同時(shí)提示糖皮質(zhì)激素可能作為α7nAChR的內(nèi)源性配體。

糖皮質(zhì)激素；小膠質(zhì)細(xì)胞；α7nAChR；尼古丁；甲基牛扁亭堿

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoids, GCs)是腎上腺皮質(zhì)分泌的內(nèi)源性分子，具有抗炎、抑制免疫反應(yīng)等多種作用，是臨床廣泛使用的抗炎藥物。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為藥理劑量GCs才具有抗炎作用，但近年的研究表明內(nèi)源性(或生理濃度)GCs同樣具有抗炎效應(yīng)，并且在很多炎癥相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1-2]。GCs是體液抗炎系統(tǒng)的重要組成部分，而神經(jīng)抗炎機(jī)制——膽堿能抗炎通路的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步豐富了機(jī)體內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)的內(nèi)涵。介導(dǎo)膽堿能抗炎通路的是迷走神經(jīng)，其通過(guò)遞質(zhì)乙酰膽堿作用于免疫細(xì)胞，抑制炎癥因子釋放起到抗炎作用，研究發(fā)現(xiàn)α7煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)處于膽堿能抗炎通路的核心，是該通路調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子[3]。我們前期發(fā)現(xiàn)，生理濃度GCs可以抑制LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，并且α7nAChR的特異性阻斷劑甲基牛扁亭堿(methyllycaconitine，MLA)可拮抗GCs的這一作用，提示GCs的抗炎作用與α7nAChR有關(guān)，兩條內(nèi)源性抗炎通路之間可能存在聯(lián)系[4]。

α7nAChR是煙堿型膽堿能受體家族的一員，由5個(gè)α7亞基構(gòu)成同源聚合體，為促離子型受體，屬于配體門(mén)控的離子通道[5]。α7nAChR開(kāi)放時(shí)可以通過(guò)鈉、鉀和鈣離子，尤其對(duì)鈣離子具有高度通透性，可影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，屬于高鈣依賴(lài)性離子通道[5]。GCs的經(jīng)典作用模式是通過(guò)與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合影響基因轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗炎作用。我們的研究顯示GCs的抗炎作用與膽堿能通路α7nAChR有關(guān)，但這一作用是否通過(guò)GCs直接影響α7nAChR功能，尚不得而知。鑒于α7nAChR是高鈣通透性離子通道，本研究擬通過(guò)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，借此反映α7nAChR開(kāi)放情況，揭示GCs是否作為內(nèi)源性配體影響α7nAChR功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞株BV-2由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供。BV-2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑和儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自Gibco公司；HBSS緩沖液(含Ca2+、Mg2+)購(gòu)自索萊寶公司；Fluo3-AM為日本同仁化學(xué)研究所產(chǎn)品；氫化可的松(hydrocortisone，Hydro)、尼古丁(nicotine，Nic)、MLA和DMSO來(lái)自Sigma公司；RU486為MCE 公司產(chǎn)品。激光共聚焦顯微鏡(A1ver 4.30)為Nikon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物處理和實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分組主要包括control、Hydro、Hydro+RU486、Hydro+MLA和Nic組，在此Nic作為陽(yáng)性對(duì)照藥。藥物的工作濃度：Hydro為300 nmol·L-1，Nic為50 μmol·L-1，糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU486為100 nmol·L-1，α7nAChR阻斷劑MLA為10 nmol·L-1。受體阻斷劑預(yù)先孵育細(xì)胞30 min后給予藥物處理。另單獨(dú)設(shè)立MLA和RU486組觀察對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響。

Fig 1 The effect of hydrocortisone on intracellular calcium in BV-2 cells

A a:Untreated cells;b:Cells were treated with hydrocortisone;c:Cells were treated with nicotine. B Statistical analysis for peak amplitude of[Ca2+]iafter drug treatment.*P<0.05vscontrol

1.2.2 Fluo3-AM負(fù)載細(xì)胞 BV-2細(xì)胞接種于共聚焦專(zhuān)用小皿，HBSS溶液洗滌細(xì)胞后加入Fluo3-AM工作液(2.5 μmol·L-1)，于37℃避光孵育30 min后除去Fluo3-AM，用HBSS溶液洗滌細(xì)胞3次備用。

1.2.3 BV-2細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光量動(dòng)態(tài)變化測(cè)定 激光共聚焦系統(tǒng)的測(cè)量參數(shù)：激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為526 nm；設(shè)置掃描的全時(shí)程為5 min，掃描間隔為每5 s一次，掃描至1.5 min時(shí)加入藥物，于第5 min停止掃描。對(duì)掃描過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)鈣水平變化的時(shí)間曲線進(jìn)行分析：細(xì)胞內(nèi)鈣水平的達(dá)峰時(shí)間、峰值持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)基態(tài)時(shí)間。使用激光共聚焦系統(tǒng)的NIS-Elements AR Analysis 4.40.00 64-bit軟件分析細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度。

Fig 2 Dynamics of intracellular calcium in response to Hydro and Nic in BV-2 cells

A:The instantaneous[Ca2+]icurve after drug treatment;B:Statistical analysis for dynamic change of[Ca2+]iafter drug treatment

2 結(jié)果

2.1 Hydro對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響 激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)掃描顯示，F(xiàn)luo3-AM負(fù)載的BV-2細(xì)胞在給予Hydro和Nic(Fig 1A)后胞內(nèi)綠色熒光明顯增強(qiáng)，而對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)無(wú)明顯綠色熒光。胞質(zhì)內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度掃描分析顯示，Hydro和Nic均可引起B(yǎng)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣的明顯升高(P<0.05)(Fig 1B)。

2.2 Hydro對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)變化過(guò)程的影響 激光共聚焦顯微鏡實(shí)時(shí)掃描BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)變化，鈣濃度變化的經(jīng)時(shí)曲線顯示在加入Hydro和Nic后細(xì)胞內(nèi)鈣立刻開(kāi)始升高：Hydro引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高在15 s左右達(dá)到峰值，持續(xù)約10 s后開(kāi)始下降；Nic引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高在28 s左右達(dá)到峰值，持續(xù)約30 s后下降(Fig 2B)。兩者引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高均在200 s左右恢復(fù)至基態(tài)(Fig 2B)。

2.3 RU486對(duì)Hydro升高小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響 為了探明Hydro引起B(yǎng)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣上升的原因，在Hydro處理前預(yù)先給予糖皮質(zhì)激素受體阻斷劑RU486孵育，結(jié)果顯示RU486不能拮抗Hydro升高BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)(P>0.05)(Fig 3)。此外，RU486單獨(dú)使用并不影響B(tài)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣水平(Fig 3)。

2.4 MLA對(duì)Hydro升高小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響 為了揭示Hydro引起B(yǎng)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣上升是否由α7nAChR介導(dǎo)，在Hydro處理前預(yù)先給予α7nAChR受體阻斷劑MLA孵育，結(jié)果顯示Hydro升高BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)被MLA拮抗(Fig 4)(P<0.05)。MLA單獨(dú)使用并不影響B(tài)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣水平(Fig 4)。

Fig 3 Effect of RU486 on elevation of intracellular calcium induced by hydrocortisone in BV-2 cells

A a: Untreated cells;b:Cells were treated with hydro;c:Cells were treated with hydro after RU486;d: Cells were treated with RU486 only.B The dynamics of intracellular calcium in response to drug indicated.*P<0.05vscontrol

3 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的巨噬細(xì)胞，參與一系列免疫反應(yīng)，尤其是在腦內(nèi)炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞上有含量豐富的糖皮質(zhì)激素受體(GRs)，亦大量表達(dá)α7nAChR，不僅是GCs的直接抗炎靶標(biāo)，也是聯(lián)接GCs(體液抗炎系統(tǒng))和膽堿能抗炎通路的重要樞紐。我們前期在小膠質(zhì)細(xì)胞的研究表明α7nAChR參與了生理濃度GCs的抗炎作用，但GCs如何影響α7nAChR功能卻不清楚。α7nAChR是高鈣通透性的陽(yáng)離子通道，在激動(dòng)劑的作用下離子通道開(kāi)放，使細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高，鈣離子內(nèi)流可引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的下游信號(hào)事件，產(chǎn)生諸多生物效應(yīng)。

Fig 4 Effect of MLA on the elevation of intracellular calcium induced by hydrocortisone in BV-2 cells

A a: Untreated cells;b:Cells were treated with hydro;c:Cells were treated with hydro after MLA;d:Cells were treated with MLA only. B The dynamics of intracellular calcium in response to drug indicated.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vshydrocortisone

本研究中使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)BV-2細(xì)胞內(nèi)鈣的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察，結(jié)果顯示在加入氫化可的松和尼古丁后細(xì)胞內(nèi)鈣立刻開(kāi)始升高，氫化可的松較尼古丁達(dá)峰時(shí)間稍快，但尼古丁引起細(xì)胞內(nèi)鈣上升的峰值更高，持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)，兩者引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高均在200 s左右恢復(fù)至基態(tài)。尼古丁是煙堿受體的特異激動(dòng)劑，研究顯示其通過(guò)激動(dòng)α7nAChR開(kāi)放離子通道使細(xì)胞內(nèi)鈣升高，發(fā)揮對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用[6]。我們的結(jié)果證實(shí)糖皮質(zhì)激素可以引起小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高，并且這一作用顯示出與尼古丁升高細(xì)胞內(nèi)鈣效應(yīng)特征的一致性。有關(guān)糖皮質(zhì)激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，結(jié)果不盡相同。在脊髓背根神經(jīng)元的研究顯示，皮質(zhì)酮可以抑制ATP引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高，并認(rèn)為這一作用與PKA通路有關(guān)[7]；在海馬神經(jīng)元的研究顯示，生理濃度的皮質(zhì)酮可以增強(qiáng)細(xì)胞去極化引起的鈣內(nèi)流，且這一作用與影響轉(zhuǎn)錄有關(guān)[8]。但上述研究結(jié)果均未證實(shí)皮質(zhì)酮通過(guò)作用于離子通道影響細(xì)胞內(nèi)鈣。

為了探明氫化可的松引起B(yǎng)V-2細(xì)胞內(nèi)鈣上升的原因，我們分別預(yù)先給予GRs和α7nAChR的阻斷劑，觀察氫化可的松對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣的影響，發(fā)現(xiàn)阻斷GRs并不影響細(xì)胞內(nèi)鈣的變化，而α7nAChR阻斷劑可拮抗氫化可的松升高細(xì)胞內(nèi)鈣的效應(yīng)。這一結(jié)果說(shuō)明氫化可的松引起小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高的效應(yīng)并不是通過(guò)其傳統(tǒng)的受體途徑實(shí)現(xiàn)，而是通過(guò)促進(jìn)α7nAChR開(kāi)放引起細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流所致。有關(guān)GCs和α7nAChR關(guān)系研究的報(bào)道一直不多。早年對(duì)小鼠大腦的放射顯影測(cè)定顯示，血漿皮質(zhì)酮水平變化可影響多個(gè)腦區(qū)α7nAChR數(shù)目[9]；隨后在腎上腺嗜鉻細(xì)胞的研究證明GCs通過(guò)早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子參與對(duì)α7nAChR基因啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)[10]。但作為小膠質(zhì)細(xì)胞上重要的抗炎靶點(diǎn)，α7nAChR和GCs的關(guān)系一直未見(jiàn)報(bào)道。本研究顯示GCs通過(guò)作用于α7nAChR引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，不僅證實(shí)和拓展了GCs藥理作用的非基因組效應(yīng)，提示GCs可作為α7nAChR的內(nèi)源性配體發(fā)揮抗炎作用；并且首次在小膠質(zhì)細(xì)胞揭示以GCs為代表的體液抗炎通路和膽堿能抗炎通路之間存在聯(lián)系，而α7nAChR作為這一連接的關(guān)鍵分子。最近的研究顯示可利用同源建模的方式研究鈣離子通道的三維結(jié)構(gòu)[11]。GCs與小膠質(zhì)細(xì)胞α7nAChR的結(jié)合形式是否可通過(guò)這種同源建模的方式進(jìn)行探索，是值得本研究去嘗試的方法。此外，體液和膽堿能抗炎通路如何在體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮作用，尚需在后續(xù)的研究工作中進(jìn)行闡明。

(致謝：本研究在廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)廣州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，特此致謝！)

[1] He Y H, Zhang H N, Zhang G P, et al. A physiological concentration of glucocorticoid inhibits the pro-inflammatory cytokine-induced proliferation of adult rat cardiac fibroblasts: roles of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and nuclear factor-κB[J].ClinExpPharmacolPhysiol, 2011, 38(11):739-46.

[2] Zhang H N,He Y H,Zhang G S, et al. Endogenous glucocorticoids inhibit myocardial inflammation induced by lipopolysaccharide: involvement of regulation of histone deacetylation[J].JCardiovascPharmacol,2012,60(1):33-41.

[3] Wang H, Yu M, Ochani M, et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation[J].Nature,2003,421:384-8.

[4] 陳依雨, 呂俊華, 張 梅.α7nAChR參與生理濃度糖皮質(zhì)激素的抗炎作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2014, 30(4): 706-10.

[4] Chen Y Y, Lyu J H, Zhang M.α7nAChR involved in anti-inflammation of physiological concentration of glucocorticoids[J].ChinJPathophys, 2014, 30(4):706-10.

[5] Amiri S,Tai K,Beckstein O,et al. The alpha7 nicotinic acetylcholine receptor: molecular modelling, electrostatics, and energetics[J].MolMembrBiol, 2005, 22(3):151-62.

[6] Toulorge D, Guerreiro S, Hild A, et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2+[J].FasebJ, 2011, 25(8):2563-73.

[7] Liu X, Zeng J, Zhao Y, et al. Inhibition of ATP-induced Ca2+influx by corticosterone in dorsal root ganglion neurons[J].NeurochemRes, 2010, 35(5):804-10.

[8] Chatterjee S, Sikdar S K. Corticosterone targets distinct steps of synaptic transmission via concentration specific activation of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors[J].JNeurochem, 2014, 128(4):476-90.

[9] Stitzel J A, Farnham D A, Collins A C. Chronic corticosterone treatment elicits dose-dependent changes in mouse brain alpha-bungarotoxin binding[J].Neuroscience, 1996, 72(3):791-9.

[10]Carrasco-Serrano C, Campos-Caro A, Viniegra S, et al. GC-and E-box motifs as regulatory elements in the proximal promoter region of the neuronal nicotinic receptor alpha7 subunit gene[J].JBiolChem, 1998, 273(32):20021-8.

[11]雷 明, 蘇敬陽(yáng), 李 卓,等. Cav1.2鈣離子通道三維結(jié)構(gòu)的同源建模及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2017, 33(1): 95-9.

[11]Lei M, Su J Y, Li Z, et al. Homology modeling and application of three dimensional structure of Cav1.2 calcium channel[J].ChinPharmacolBull, 2017, 33(1): 95-9.

Effects of glucocorticoids on intracellular calcium in microglial cells

HE Shu-qiao, QIAN Xu, ZHANG Gui-ping, ZHANG Wei-wen, ZHANG Mei

(DeptofPharmacology,SchoolofPharmaceuticalSciences,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China)

Aim To explore the effects of hydrocortisone on intracellular calcium in microglial cells.Methods The intracellular calcium was measured by instantaneous scanning with confocal laser microscope(CLM) in BV-2 cells, and fluo3-AM was used to dye the intracellular calcium.Results Both hydrocortisone and nicotine could obviously increase intracellular calcium in BV-2 cells(P<0.05). It was indicated by instantaneous scanning with CLM that hydrocortisone induced the rising of intracellular calcium immediately, and reached the peak about at the fifteenth second, and sustained for 10 seconds, then declined to baseline at 200th second. The effect of hydrocortisone on intracellular calcium exhibited a highly consistency with nicotine. Antagonist of glucocorticoid receptors RU486 could not abolish the rising of intracellular calcium induced by hydrocortisone(P>0.05); but the blocker of α7 nicotinic acetylcholine receptor(α7nAChR) methyllycaconitine could suppress the rising of intracellular calcium induced by hydrocortisone(P<0.05).Conclusion Hydrocortisone enhances intracellular calcium via α7nAChR in microglial cells, which not only demonstrates the non-genomic effect of glucocorticoid, but also suggests that glucocorticoid could serve as endogenous ligand of α7nAChR.

glucocorticoid；microglia；α7nAChR；calcium；nicotine；MLA

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.052.html

2016-12-15,

2017-01-10

廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No 2013B022000096)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 2016A030313568)

何舒翹(1991-)，女，碩士生，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué),E-mail: 1547227027@qq.com； 張 梅(1971-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué),通訊作者,E-mail: zhmeic@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.026

A

1001-1978(2017)06-0878-06

R322.8；R348.1；R392.11；R977.11