CMPK1蛋白與阿霉素引起的多藥耐藥的相關(guān)性研究

陳淑嫻，葉向暉，王 敘，金 堅(jiān)

(江南大學(xué)藥學(xué)院 藥物設(shè)計(jì)與分子藥理研究室，江蘇 無(wú)錫 214122)

CMPK1蛋白與阿霉素引起的多藥耐藥的相關(guān)性研究

陳淑嫻，葉向暉，王 敘，金 堅(jiān)

(江南大學(xué)藥學(xué)院 藥物設(shè)計(jì)與分子藥理研究室，江蘇 無(wú)錫 214122)

阿霉素；IC50；藥敏性；多藥耐藥；CMPK1;紫杉醇;吉西他濱

多藥耐藥(multidrug resistance, MDR)是在藥物治療的過(guò)程中，經(jīng)一種藥物的誘發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能各異的藥物也產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，具廣譜耐藥特性[1]。腫瘤細(xì)胞的MDR嚴(yán)重影響了臨床療效及患者預(yù)后，是引發(fā)化療失敗的主要原因[2]。MDR的機(jī)制較為復(fù)雜，單一靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物極易產(chǎn)生耐藥[3]，蒽環(huán)類化合物阿霉素(Adriamycin, ADM)雖自20世紀(jì)70年代進(jìn)入臨床使用以來(lái)就迅速成為乳腺癌一線使用藥物，并被美國(guó)FDA認(rèn)為最有效的化療藥物之一[4-5]，但近些年日趨嚴(yán)重的MDR現(xiàn)象嚴(yán)重制約了其作為臨床一線用藥的使用，相較于MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究，對(duì)MDR具體機(jī)制的探究則更為迫切。我們此前首次應(yīng)用含17 000種蛋白的芯片對(duì)阿霉素的作用靶點(diǎn)進(jìn)行了研究，初步篩選出了14個(gè)阿霉素可能的作用靶點(diǎn)。針對(duì)近些年出現(xiàn)的阿霉素耐藥現(xiàn)象，本文著重篩選阿霉素耐藥相關(guān)蛋白并加以解析。

CMPK1定位于細(xì)胞質(zhì)，以ATP為磷酸供體，將單磷酸胞苷酸(CMP)、尿苷酸(UMP)和脫氧胞苷酸[(d)CMP]磷酸化為對(duì)應(yīng)的雙磷酸胞苷酸(CDP)、尿苷酸(UDP)和脫氧胞苷酸[(d)CDP]，為胞內(nèi)的核酸合成提供前體物質(zhì)，在細(xì)胞中起著重要的作用[6]。同時(shí)，CMPK1還可以有效激活脫氧胞苷酸類似物的活性，這些脫氧胞苷酸類似物可被用于抑制腫瘤或抗病毒方面的治療，包括吉西他濱被用于胰腺癌等實(shí)體瘤、Ara-C被用于惡性血液??；并且ddC，3-TC可有效地抗自身免疫性病毒及乙肝病毒[7]。CMPK1是非小細(xì)胞肺癌和吉西他濱相關(guān)化療方案預(yù)后因子[8-9]。在三陰性乳腺癌中CMPK1的細(xì)胞核定位可提示治療的不良預(yù)后[10]。CMPK1與ADM的關(guān)系還未被研究過(guò)，本文著重探究CMPK1蛋白與阿霉素耐藥的關(guān)系，并解析CMPK1低表達(dá)引發(fā)細(xì)胞阿霉素耐藥的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK293細(xì)胞、MCF7細(xì)胞均引自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，MCF7/ADM細(xì)胞為筆者實(shí)驗(yàn)室建株。質(zhì)粒、CMPK1抗體均來(lái)源于Origen公司。羊抗鼠辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗為Proteintech公司產(chǎn)品。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipo2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑均為Invitrogen公司產(chǎn)品。胰酶/EDTA、雙抗均為吉諾公司產(chǎn)品。Cell-Titer Blue細(xì)胞活性檢測(cè)試劑為Promega公司產(chǎn)品。CMPK1 siRNA為Santa Cruz公司產(chǎn)品。阿霉素購(gòu)自大連美侖，紫杉醇購(gòu)自紅豆杉藥業(yè)，吉西他濱為MedChem Express公司產(chǎn)品。RIPA裂解液購(gòu)自碧云天。ECL顯色試劑盒為七海生物公司產(chǎn)品。RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素和100 kU·L-1鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，MCF7細(xì)胞及MCF7/ADM細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)補(bǔ)加終濃度2 kU·L-1的胰島素，放置于37℃，5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時(shí)使用0.25%胰酶/EDTA。

1.2.2 質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至匯合度達(dá)80%～90%，胰酶消化收集細(xì)胞，每皿5×106加到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按照Lipo 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，18～40 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 IC50檢測(cè) 參照馬曉峰等[11]，消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，按照5 000～8 000/孔接種于96孔細(xì)胞板。將待測(cè)藥物進(jìn)行倍比稀釋，吸除96孔板中的培養(yǎng)基，將稀釋好的藥物按照每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔加入到96孔板內(nèi)，每孔100 μL，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)48 h，取出96孔板，每孔加入10 μL CellTiter Blue試劑，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)1～4 h，取出96孔板于酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔熒光值IF(Excitation:560 nm;Emission:590 nm)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力，Graph Pad 5.0作圖進(jìn)行IC50分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 按照試劑盒要求操作，提取細(xì)胞RNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific公司)檢測(cè)RNA濃度和純度，10%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增序列見Tab 1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，紫外燈凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image J分析各PCR條帶灰度值，Graph Pad軟件作圖分析。

1.2.5 Western blot (WB)檢測(cè)蛋白表達(dá) 胰酶消化收集細(xì)胞，并用PBS離心法洗滌3次，每次3 min，500×g，4℃。向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入RIPA后混勻并置于冰上裂解10 min，12 000×g離心15 min，取上清，NanoDrop 2 000檢測(cè)蛋白濃度后將蛋白用RIPA調(diào)整至相同濃度，加入上樣緩沖液于100℃熱變性5 min，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，取出凝膠，按照順序放置凝膠及PVDF膜后調(diào)整電壓(100 V)及時(shí)間(60 min)，轉(zhuǎn)膜后取出PVDF膜，加入封閉液(5%脫脂奶粉：TBS配制)封閉1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗滌3次，每次5 min，加入二抗37℃孵育1 h，按照ECL顯色說(shuō)明書要求進(jìn)行顯色，于成像儀進(jìn)行拍照。Image J分析各條帶灰度值，Graph Pad軟件作圖分析。

Tab 1 Primer for 14 genes of protein candidates and β-actin gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Graph Pad軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞藥敏性檢測(cè) Fig 1是分別轉(zhuǎn)染14種質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞以及未轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50，由圖可見，與野生型細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后IC50增加的有：DYNLL1和COX6B2；轉(zhuǎn)染后IC50降低的有：TNFAIP6、APOA2、TRMT112、MGAT1、COASY、CMPK1、CLIC1、DVL2。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的IC50增加的程度較低，與對(duì)照組的比值均在2以內(nèi)，而轉(zhuǎn)染后IC50減少的細(xì)胞中，CMPK1過(guò)表達(dá)的細(xì)胞IC50最低，IC50HEK293-CMPK1/IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01。提示作為轉(zhuǎn)染后IC50變化最大的表達(dá)蛋白，CMPK1與細(xì)胞耐藥相關(guān)的可能性較大，CMPK1高表達(dá)細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性降低，藥敏性提高。

2.2 RT-PCR檢測(cè)CMPK1基因表達(dá) 實(shí)驗(yàn)室人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞MCF7/ADM是張蓮芬等[12]建立的。RT-PCR對(duì)人乳腺癌親本細(xì)胞MCF7和阿霉素耐藥細(xì)胞MCF7/ADM內(nèi)的14種相關(guān)基因進(jìn)行分析，耐藥細(xì)胞MCF7/ADM細(xì)胞中的CMPK1基因表達(dá)低于親本細(xì)胞MCF7(P<0.05)。

Fig 1 IC50 assay of overexpression HEK293 cells to ADM

1：Control;2:TNF AIP6;3:APOA2;4:DYNLL1;5:TRMT112;6:MGAT1;7:SLC22A6;8:COASY;9:CMPK1;10:COX6B2;11:CLIC2;12:DVL2;13:ZNF684;14:TRDMT1;15:H3F3B.*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 2 RT-PCR assay of gene expression in MCF7 cells and MCF7/ADM cells

ρ,means the expression of certain gene over β-actin gene.1:TNFAIF6;2:APOA2;3:DYNLL1;4:TRMT112;5:MGAT1;6:SLC22A6;7:COASY;8:CMPK1;9:COX6B2;10:CLIC2;11:DVL2;12:H3F3B;13:TRDMT1;14:ZNF684.*P<0.05,**P<0.01vsMCF7

2.3 WB檢測(cè)CMPK1蛋白表達(dá) Fig 3顯示人乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF7/ADM中CMPK1蛋白的表達(dá)水平低于親本MCF7細(xì)胞(P<0.01)，CMPK1蛋白的表達(dá)在耐藥細(xì)胞中有所降低，CMPK1表達(dá)的降低可能與細(xì)胞耐藥相關(guān)。

2.4 CMPK1 siRNA作用后藥敏性變化 MCF7細(xì)胞轉(zhuǎn)染CMPK1 siRNA后，CMPK1蛋白表達(dá)水平下降(Fig 4)，細(xì)胞對(duì)阿霉素的IC50增加：IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=4.8,P<0.05，且CMPK1低表達(dá)的細(xì)胞對(duì)紫杉醇(IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6)、吉西他濱(IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.5)的IC50也增加，P<0.05(Tab 2)，表明CMPK1表達(dá)水平降低的同時(shí)，也降低了細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的藥敏性。細(xì)胞對(duì)藥物的耐受性增加。

Fig 3 WB assay of CMPK1 expression in MCF7 cells and MCF7/ADM cells

**P<0.01vscontrol

Fig 4 Expression of CMPK1 in CMPK1 siRNA transfected MCF7 cells and non-transfected control

**P<0.01vscontrol

Tab 2 IC50 assays of CMPK1 siRNA transfected MCF cells and non-transfected control MCF7 cells

σ,means IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control,*P<0.05vscontrol

3 討論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的與阿霉素引起的多藥耐藥相關(guān)的主要是ABC(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族主要包括P糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白等[13]。多藥耐藥細(xì)胞還表現(xiàn)出失巢凋亡(Anoikis)逃避現(xiàn)象[14]。藥物在胞內(nèi)的再修飾作用也與耐藥相關(guān)，譬如參與阿霉素代謝修飾的醛酮還原酶家族[15]及羰基還原酶家族[16]等，將阿霉素代謝為阿霉素醇，從而減弱了阿霉素本身插入DNA的功能，文獻(xiàn)表明阿霉素醇的毒性較阿霉素小了數(shù)10倍之多[17]，阿霉素耐藥細(xì)胞中這些酶的表達(dá)要遠(yuǎn)高于野生型細(xì)胞。

文中所用的14中質(zhì)粒是此前實(shí)驗(yàn)組在Origene公司17K蛋白芯片[18]上的陽(yáng)性篩選結(jié)果對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒，前期實(shí)驗(yàn)表明該14種質(zhì)粒表達(dá)的蛋白皆為阿霉素在細(xì)胞內(nèi)可能的作用靶點(diǎn)，阿霉素引起的耐藥已經(jīng)引起眾多研究者的注意并迫切需要解決，本文暫從細(xì)胞耐藥方面考慮，從14個(gè)可能的結(jié)合位點(diǎn)中篩選阿霉素耐藥相關(guān)蛋白。HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率比較高，可以達(dá)到80%～90%。在不考慮質(zhì)粒個(gè)體轉(zhuǎn)染差異的前提下，我們選取了IC50變化最大的表達(dá)蛋白CMPK1作為研究對(duì)象。

文中藥敏性檢測(cè)結(jié)果表明CMPK1蛋白表達(dá)的增加提高了阿霉素的藥敏性。Réjiba等[19]還發(fā)現(xiàn)CMPK1蛋白表達(dá)的增加亦可提高吉西他濱、氟尿嘧啶等核苷類似物的藥敏性，并且Humeniuk等[20]發(fā)現(xiàn)氟尿嘧啶耐藥細(xì)胞及吉西他濱耐藥細(xì)胞中CMPK1的蛋白表達(dá)均有所下降，而本文阿霉素耐藥細(xì)胞中CMPK1的蛋白表達(dá)亦有所下降，RT-PCR結(jié)果還表明耐藥細(xì)胞的CMPK1基因表達(dá)降低。本文所用的阿霉素非核苷類似物，阿霉素耐藥細(xì)胞中CMPK1蛋白含量的變化由因化療藥阿霉素引起，因而可以推斷化療藥物阿霉素可能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)CMPK1蛋白含量的降低，進(jìn)而引起細(xì)胞對(duì)多種藥物的耐藥，包括核苷類似物、紫杉醇類似物等的耐藥。

CMPK包括CMPK1和CMPK2，CMPK2主要分布于線粒體[21]，因而研究較多的為CMPK1，核苷類似物與CMPK1耐藥的關(guān)系是由于CMPK1對(duì)核苷類似物的激活作用，因而其含量的變化與藥物的效能密切相關(guān)。筆者對(duì)與CMPK1激酶作用后的ADM進(jìn)行HPLC及LC/MS分析，研究表明與CMPK1作用后ADM本身的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化或修飾，而是CMPK1的活性在ADM存在的情況下有所激活，因此我們猜測(cè)ADM耐藥細(xì)胞導(dǎo)致CMPK1表達(dá)量的降低可能是由于ADM的持續(xù)使用而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)CMPK1活性的持續(xù)增加，而機(jī)體需要的CMPK1發(fā)揮的活性的量是一定的，細(xì)胞機(jī)體因此進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)，因而減少了CMPK1在蛋白水平的表達(dá)，進(jìn)而又影響到ADM及其他藥物的藥敏性。研究又表明CMPK1可能與細(xì)胞外基質(zhì)的紊亂及細(xì)胞周期的失調(diào)相關(guān)[10]，紫杉烷類主要是影響細(xì)胞微管及微絲的聚合，影響細(xì)胞周期，因而CMPK1的變化引發(fā)紫杉醇的耐藥可能與此相關(guān)。

簡(jiǎn)言之，CMPK1的表達(dá)與細(xì)胞對(duì)阿霉素的藥敏性呈正相關(guān)，并可能因此引起紫杉烷類及核苷類似物的耐藥。

(致謝：感謝前期Origen technology公司提供的蛋白芯片及技術(shù)支持，再此表示由衷的感謝。)

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Relationship between CMPK1 protein and ADM caused multidrug resistance

CHEN Shu-xian,YE Xiang-hui， WANG Xu， JIN Jian

(LaboratoryofdrugdesignandMolecularPharmacology，SchoolofMedicineandPharmaceutics，JiangnanUniversity，WuxiJiangsu214122，China)

Aim To assay the possible targets of adriamycin (ADM), screening ADM resistance related proteins. Methods The drug sensitivity of the cells was analyzed by IC50assay; RT-PCR assay was used to detect the expression of genes in the cells; CMPK1 protein expression was tested by Western blot assay; the expression of CMPK1 in the cells was decreased by siRNA of CMPK1. Results Data from IC50assay showed the sensitivity of cells transfected with CMPK1 was increased most(IC50HEK293-CMPK /IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01), and the expression of CMPK1 protein in ADM resistant breast cells (MCF7/ADM) was lower than that in parent MCF7 cells (P<0.05). When the expression level of CMPK1 was decreased by CMPK1 siRNA, the sensitivity of MCF7 cells to ADM decreased (IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6,P< 0.01), and the sensitivity of MCF7 cells to paclitaxel and gemcitabine also decreased. Conclusions CMPK1 was related to the multidrug resistance of cells, and the expression of CMPK1 was positively related to the sensitivity to drugs, which provides the possibility of CMPK1 as a target in the treatment of multidrug resistance.

adriamycin; IC50; drug sensitivity; CMPK1; paclitaxel; gemcitabine

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.020.html

2017-01-10,

2017-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(No 81361168001)；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)(No BL 2014019)

陳淑嫻(1986-)，女，博士，研究方向：藥物設(shè)計(jì)與分子藥理學(xué)，E-mail：csx.ss@163.com； 金 堅(jiān)(1960-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：藥物設(shè)計(jì)與分子藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：jinjian31@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.010

A

1001-1978(2017)06-0788-05

R329.24；R394.2；R737.902.2；R737.905.3；R979.1；R977.6摘要：目的 對(duì)阿霉素可能的作用靶點(diǎn)進(jìn)行分析，篩選阿霉素耐藥相關(guān)蛋白。方法 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK239細(xì)胞以構(gòu)建蛋白高表達(dá)模型；IC50檢測(cè)細(xì)胞的藥敏性；RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)；Western blot檢測(cè)CMPK1蛋白的表達(dá)；CMPK1 siRNA構(gòu)建CMPK1蛋白低表達(dá)模型。結(jié)果 IC50檢測(cè)結(jié)果表明高表達(dá)CMPK1蛋白的細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加程度最大(IC50HEK293-CMPK1/IC50HEK293-Control=0.15,P<0.01)，且阿霉素耐藥細(xì)胞(MCF7/ADM)中CMPK1蛋白的表達(dá)低于乳腺癌親本細(xì)胞MCF7(P<0.05)。MCF7細(xì)胞中，CMPK1蛋白表達(dá)水平經(jīng)CMPK1 siRNA下調(diào)之后，對(duì)阿霉素的藥敏性隨之降低 (IC50MCF7-siCMPK1/IC50MCF7-Control=3.6,P<0.01)，且對(duì)紫杉醇、吉西他濱的藥敏性也隨之降低。結(jié)論 CMPK1與細(xì)胞的多藥耐藥相關(guān)，且CMPK1蛋白的表達(dá)與藥敏性呈正相關(guān)，提示了CMPK1作為多藥耐藥治療靶點(diǎn)的可能性。