2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的改變及Sirt1的調(diào)控機(jī)制研究

孫曉慧，王 燕，牟艷玲

(1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062;3.國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062;4.山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062)

2型糖尿病大鼠心肌PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的改變及Sirt1的調(diào)控機(jī)制研究

孫曉慧1,2,3,4，王 燕2,3,4，牟艷玲2,3,4

(1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062;3.國(guó)家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062;4.山東省罕少見(jiàn)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250062)

目的 檢測(cè)Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白在糖尿病大鼠心肌及高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中的表達(dá)變化，明確其在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立2 型糖尿病大鼠模型，實(shí)驗(yàn)將大鼠分為糖尿病2周、4周、8周模型組和對(duì)照組，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能變化，Western blot檢測(cè)大鼠心肌Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1蛋白表達(dá)變化。將H9C2細(xì)胞分為正常對(duì)照組、DMSO組(78.12 mmol·L-1)、高糖(HG)組(33 mmol·L-1)、白藜蘆醇(Res)組(20 μmol·L-1)、尼克酰胺(Nam)組(40 mmol·L-1)，Western blot及qRT-PCR研究心肌細(xì)胞Sirt1、PI3K、Akt、mTOR、S6K1相關(guān)蛋白基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，研究Sirt1對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果 在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與2周DM大鼠比較，8周DM大鼠心肌Sirt1蛋白表達(dá)明顯增加。2周模型組大鼠相對(duì)于正常對(duì)照組心肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1表達(dá)明顯增加，且S6K1表達(dá)4 周模型組比2周模型組增加更明顯，但8周表達(dá)降低。在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，高糖組Sirt1, PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達(dá)明顯增高。Nam處理組Sirt1表達(dá)明顯降低，PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達(dá)增高。Res處理組Sirt1表達(dá)明顯增高，而PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達(dá)降低。結(jié)論 Sirt1通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路參與糖尿病心肌損傷，參與早期糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

2型糖尿??；PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路；Sirt1；心功能；心肌損傷；白藜蘆醇；尼克酰胺

近年來(lái)，糖尿病(diabetes mellitus，DM)患病率急劇上升，已成為影響人類(lèi)身體健康的主要疾病之一。糖尿病若未能得到及時(shí)診斷和正規(guī)治療，可引起多種慢性并發(fā)癥。其中，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是DM心血管并發(fā)癥中一種獨(dú)立、特異的心肌病，與糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和死亡率升高密切相關(guān)，是DM患者死亡的主要原因[1]。 研究表明，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化，其過(guò)度激活參與糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、認(rèn)知功能障礙和胰島素抵抗等[2]。此外，Sirt1作為體內(nèi)關(guān)鍵的生物信號(hào)調(diào)節(jié)因子，廣泛參與多種信號(hào)通路的激活與抑制調(diào)控，已被廣泛研究。有研究表明[3]，Sirtl失活條件下，PI3K/Akt/mTOR通路激活，進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。而在2型DCM中，Sirt1對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控作用尚未明確。本文通過(guò)檢測(cè)Sirtl及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白在DM大鼠心肌及高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中的表達(dá)變化，并將白藜蘆醇和尼克酰胺——Sirt1的特異性激動(dòng)劑及抑制劑作用于高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，探討Sirtl對(duì)該信號(hào)通路的調(diào)控作用，為糖尿病心肌病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立 體質(zhì)量200～220 g的♂健康SD大鼠40只，購(gòu)自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用高脂飲食(豬油30%，膽固醇2.5%，脫氧膽酸鈉1%,常規(guī)飼料66.5%)隨機(jī)對(duì)30只大鼠灌胃，設(shè)為糖尿病模型組(DM組)，另設(shè)正常對(duì)照組(Control組)10只，并于5周末禁食12 h后，DM組大鼠一次性腹腔注射1%鏈脲菌素(30 mg·kg-1，pH=4.5檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液)，Control組大鼠注射同體積檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液。72 h后尾靜脈采血，血糖試紙檢測(cè)空腹血糖值(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)。DM組造模成功大鼠隨機(jī)分為2周模型組、4周模型組和8周模型組，繼續(xù)高脂飲食灌胃，Control組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)8周。

1.2 細(xì)胞及模型建立 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2，由美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所提供。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分為正常對(duì)照組、DMSO組(78.12 mmol·L-1)、高糖(HG)組(33 mmol·L-1)、白藜蘆醇(Res)組(20 μmol·L-1)、尼克酰胺(Nam)組(40 mmol·L-1)，作用24 h。

1.3 材料與試劑 鏈脲菌素、戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司)；血糖試紙(強(qiáng)生中國(guó)醫(yī)療器材有限公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TRIzol(上海東洋紡生物科技有限公司)；RIPA裂解液、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和SDS-PAGE電泳液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF膜(0.45 μm，美國(guó)SERVA公司)；所用單克隆抗體為：Sirt1(美國(guó)Novus公司)，PI3K、Akt、mTOR(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，S6K1(美國(guó)Abcam公司)。

1.4 大鼠空腹血糖檢測(cè) DM組大鼠分別于2、4和8周末禁食12 h，頸靜脈竇取血，離心分離血清，檢測(cè)FBG及胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitive index，ISI)，公式為 ISI=ln[1/(FINS×FBG)]。

1.5 大鼠超聲心動(dòng)圖 大鼠分別于造模2、4、8周末，禁食12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，并固定于手術(shù)臺(tái)上，使用小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)Vevo 2100(維勝中國(guó))檢測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-systole，LVIDs)、左室舒張末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in diastole，LVPWd)、左室收縮末期室壁厚度(left ventricular posterior wall thickness in systole，LVPWs)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction, LVEF)及左心室質(zhì)量(left ventricular mass，LV Mass)。

1.6 大鼠心肌標(biāo)本收集 大鼠麻醉后迅速取出心臟，用預(yù)冷生理鹽水洗凈并用濾紙吸干，剔除血管、脂肪等非心肌組織，分別稱(chēng)取心臟重量(heart weight，HW)和左心室(含室間隔)重量(LV Mass)，并計(jì)算心臟(左心)指數(shù)=心臟(左心室)重量(mg)/體重(g)，置于-80℃中保存待用。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取蛋白，BCA法測(cè)定各組總蛋白濃度，于SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離。冰浴下濕法轉(zhuǎn)膜2h后，用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜。次日與辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的二抗共孵育，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，并利用灰度分析軟件定量分析。

1.8 qRT-PCR 將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，1 000 r·min-1，離心5 min收集細(xì)胞。按TRIzol提取程序(說(shuō)明書(shū))提取細(xì)胞總RNA，按AWV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后，4℃保存。各目的基因的擴(kuò)增引物序列如Tab 1所示，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃變性30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min，快速冷卻至4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠成像儀觀(guān)察。用BandScan5.0軟件測(cè)定條帶灰度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

Tab 1 PCR primer used in experiment

2 結(jié)果

2.1 大鼠DM模型建立情況 實(shí)驗(yàn)期間，Control組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，對(duì)外界反應(yīng)靈敏，無(wú)死亡。與Control組比較，DM組大鼠精神萎靡，皮毛無(wú)光澤，出現(xiàn)多飲、多食、多尿，腥臊酮臭味加重等。STZ造模后72 h，檢測(cè)高糖模型成功28只。DM組大鼠與對(duì)照組大鼠比較，血清FBG、FINS明顯升高(P<0.05)，ISI明顯下降(P<0.01)，表明2型糖尿病大鼠造模成功。見(jiàn)Tab 2。

GroupnFBG/mmol·L-1FINS/mU·L-1ISIControl105.973±0.13722.147±0.586-5.084±0.998DMMod-el2831.341±0.368*28.817±0.743*-7.132±0.577**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

2.2 糖尿病大鼠超聲心動(dòng)圖變化 與對(duì)照組比較，2周 DM大鼠的LVIDd及LVIDs值明顯增大(P<0.05)，LVPWd及LVPWs明顯增厚(P<0.05)，F(xiàn)S及LV Mass值明顯降低(P<0.01)，LVEF及LVMass/Body Weight值無(wú)明顯變化；隨著糖尿病的發(fā)展，4周、8周 LVIDd、LVIDs、LVPWd及LVPWs值增加更明顯(P<0.01)，F(xiàn)S、LVEF及LV Mass值降低更明顯(P<0.01)，LV Mass/Body Weight值增加更明顯(P<0.01)，且與2周 DM組比較，都具有明顯差異(P<0.05)。見(jiàn)Fig 1和Tab 3。

Tab 3 Changes of structural and functional parameters in left ventricle of DM ±s)

LVIDd, Left ventricle(LV) internal diameter in diastole;LVIDs,LV internal diameter in systole;LVEF,LV ejection fraction;FS,fractional shortening,and LV Mass(AW) were automatically calculated by the ultrasound machine.*P<0.05,**P<0.01vsND group;△P<0.05,△△P<0.01vs2 week DM

Fig 1 Representative images of M-modechocardiogram

A:Control group;B:2 wk DM;C:4 wk DM; D:8 wk DM

2.3 糖尿病大鼠心肌SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化 WB結(jié)果表明，2周、4周 DM大鼠心肌中Sirt1蛋白的表達(dá)相對(duì)于Control組無(wú)明顯變化，但與2周 DM大鼠比較，8周 DM大鼠心肌表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與Control組大鼠比較，2周 DM大鼠PI3K、Akt、mTOR及S6K1表達(dá)明顯增加(P<0.01)，2周之后，PI3K、Akt、mTOR表達(dá)無(wú)明顯變化，但S6K1在4周增加最明顯(P<0.01)，8周表達(dá)降低。見(jiàn)Fig 2。

2.4 高糖條件下大鼠心肌細(xì)胞SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的變化 WB結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，高糖組Sirt1, PI3K, Akt, mTOR 和S6K1表達(dá)明顯增高。與高糖組相比，Nam處理組Sirt1表達(dá)明顯降低，PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達(dá)增高。Res處理組PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達(dá)降低，結(jié)果見(jiàn)Fig 3。

Fig 2 Expression of PI3K,Akt,mTOR,S6K1,Sirt1 in cardiac tissue from each group via ±s,n=28)

A:Respresentative Western blot analysis of the time-dependent changes of protein levels; B:Bar graph shows quantification of protein levels(fold of net intensity of bands with β-actin).**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vs2 wk DM

2.5 qRT-PCR檢測(cè)高糖條件下大鼠心肌細(xì)胞SIRT1/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的變化 qRT-PCR結(jié)果與上述WB結(jié)果相一致，高糖培養(yǎng)H9C2細(xì)胞中Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因(PI3K、 Akt、mTOR、S6K1)表達(dá)明顯增高。Nam處理組Sirt1表達(dá)明顯降低， PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)增高。Res處理組Sirt1表達(dá)明顯增高，而PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)降低，見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 Expression of Sirt1,PI3K,Akt,m-TOR

A:Respresentative Western blot analysis of the changes of protein levels; B:Bar graph shows quantification of protein levels(fold of net intensity of bands with β-actin).**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsHG group

Fig 4 The mRNA expression of Sirt1,PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in total RNA extracts from H9C2 cells using ±s)

Bar graph shows quantification of mRNA expression(2-ΔCt).**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHG

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是目前研究的熱點(diǎn)[4]。PI3K作為該信號(hào)通路的起始因子，可被多種生長(zhǎng)因子激活，各種生長(zhǎng)因子作用于膜受體而使PI3K激活，然后質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt和PDK1結(jié)合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Thr308位點(diǎn)，促使Akt活化?；罨腁kt可以磷酸化激活其下有多種靶蛋白如mTOR，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞存活，是重要的抗凋亡調(diào)節(jié)因子。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent informationregulator1，Sirt1)為哺乳動(dòng)物Sirtuins家族成員之一，是一種依賴(lài)于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的去乙?；?，與酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent informationregulator 2, Sir2)高度同源。人們將在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的Sir2的同源基因按照其發(fā)現(xiàn)的先后順序依次稱(chēng)為Sirt1-7，并統(tǒng)稱(chēng)為Sirtuins家族。其中，Sirt1在DNA修復(fù)、體內(nèi)能量平衡、氧化還原平衡、抗衰老及胰島素分泌等方面具有重要的調(diào)控功能[5-6]。白藜蘆醇是葡萄中含有的一種多羥基酚類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管、保護(hù)肝細(xì)胞、抗肥胖的功效，特異性激活Sirt1[7]，提高Sirt1蛋白表達(dá)量并升高其活性[8]。尼克酰胺是Sirt1特異性抑制劑，能防止STZ處理的胰島細(xì)胞中NAD+減少，抑制胰島素前體合成，延遲STZ誘導(dǎo)的糖尿病的發(fā)生[9]。Sirt1可以通過(guò)調(diào)節(jié)FOXOs、Wnt等相關(guān)信號(hào)通路，對(duì)多種心血管疾病的病理生理過(guò)程產(chǎn)生重要影響，發(fā)揮保護(hù)心肌、舒張血管、抑制動(dòng)脈粥樣硬化等作用[10-12]。研究表明[13]，Sirt1可以通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。Takeda等[3]認(rèn)為，在單核-吞噬細(xì)胞中，Sirtl失活條件下，PI3K/Akt/mTOR通路激活，進(jìn)而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生。但是，Sirt1在2型糖尿病心血管系統(tǒng)對(duì)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的調(diào)節(jié)還不清楚。

本研究表明，DM大鼠Sirt1及PI3K、Akt、mTOR表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，其下游S6K1表達(dá)2周模型組大鼠相對(duì)于正常對(duì)照組表達(dá)明顯增加，且4周模型組比2 周模型組增加更明顯，8周表達(dá)降低，說(shuō)明8周之內(nèi)Sirt1被激活，而PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有表達(dá)降低的趨勢(shì)，因此我們推斷，在2型DCM中，Sirt1可抑制該信號(hào)通路的表達(dá)。為了研究二者之間的調(diào)控機(jī)制，我們采用體外研究的方法，構(gòu)建細(xì)胞高糖模型。在高糖培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中，WB及qRT-PCR結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，高糖組Sirt1、PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達(dá)明顯增高，表明高糖條件下H9C2細(xì)胞Sirt1及PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活，與DM大鼠心肌中相應(yīng)蛋白表達(dá)結(jié)果相一致。Nam處理組Sirt1表達(dá)明顯降低，導(dǎo)致PI3K、Akt、mTOR和S6K1表達(dá)增高。Res處理組Sirt1表達(dá)明顯增高，而PI3K, Akt, mTOR和S6K1表達(dá)降低。表明在高糖誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中，Sirt1低表達(dá)時(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路激活；Sirt1高表達(dá)時(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被抑制。因此，我們得出結(jié)論，Sirt1作為PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的上游調(diào)節(jié)因子，通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Sirt1/PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中被激活，參與早期糖尿病心肌損傷。糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，是糖尿病心血管?chē)?yán)重并發(fā)癥的重要組成部分，明確其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中心肌相關(guān)指標(biāo)的變化，進(jìn)而做到早期診斷成為研究熱點(diǎn)。我們將深人了解其在糖尿病心肌病中的作用并闡明其機(jī)制，以期為糖尿病心肌病的早期治療提供理論依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)全部由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室牟艷玲老師課題組獨(dú)立完成，感謝山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程的資助。)

[1] 尹茂山, 許淑紅, 王 燕, 等. 2型糖尿病大鼠主動(dòng)脈Wnt/-catenin信號(hào)通路的變化及SIRT1的調(diào)節(jié)作用[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2016, 33(3): 337-42.

[1] Yin M S, Xu S H, Wang Y, et al. Alteration of Wnt/-catenin signaling pathway in type 2 diabetic rats′aorta and regulation of SIRT1[J].ChinPharmacolBull, 2016, 33(3): 337-42.

[2] Zhang C, Yoon M S, Chen J. Amino acid-sensing mTOR signaling is involved in modulation of lipoly by chronic insulin treatment in adipocytes[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab, 2009, 296(4): 862-8.

[3] Takeda W A, Kitada M, Kanasaki K, et al. SIRT1 in activation induces inflammation through the dysregulation of autophagy in human THP-1 cells[J].BiochemBiophysResCommun, 2012, 427(1): 191-6.

[4] Papadimitrakopoulou V.Development of PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors and their application in personalized therapy for non-small-cell lung cancer[J].JThoracOncol,2012,7(8):1315-26.[5] Vetterli L, Brun T, Giovannoni L, et al. Resveratrol potentiates glucose-stimulated insulin secretion in INS-1E beta-cells and human islets through a SIRT1-dependent mechanism[J].JBiolChem,2011,286:6049-60.

[6] Shoba B,Lwin Z M,Ling L S, et al. Function of sirtuins in biological tissues[J].AnatRec,2009,292:536-43.

[7] Bagul P K,Banerjee S K. Application of resveratrol in diabetes: rationale, strategies and challenges[J].CurrMolMed,2015,15:312-30.

[8] Jian B. Resveratrol restores Sirtuin(SIRT1) activity and pyruvate dehydrogenase kinase1 expression after hemorrhagic injury in a rat model[J].MolMed, 2014, 20(1):10-6.

[9] Zhang Y, Rosnberg P A. Caspase-1 and poly(ADP-tibose) polymerase inhibitors may protect against peroxynitrite-induced neurotoxicity independent of their enzyne inhibitor activity[J].EurJNeurosci, 2014, 20(7): 1727-36.

[10]Cappetta D, Esposito G,Piegari E,et al. SIRT1 activation attenuates diastolic dysfunction by reducing cardiac fibrosis in a model of anthracycline cardiomyopathy[J], 2016,15(205):99-110.

[11]Hu M Z,Zhou B,Mao H Y, et al.Exogenous hydrogen sulfide postconditioning protects isolated rat hearts from ischemia/reperfusion injury through Sirt1/PGC-1α signaling pathway[J].IntHeartJ,2016,29:3249-99.

[12]尹茂山, 牟艷玲. Sirt1與心肌保護(hù)[J]. 生命科學(xué), 2015, 27(5): 601-7.

[12]Yin M S, Mu Y L. The function of Sirt1 in myocardial protection[J].ChinBullofLifeSci, 2015, 27(5): 601-7.

[13]Ma L,Dong W,Wang R,et al. Effect of caloric restriction on the SIRT1/mTORsignaling pathways in senile mice[J].BrainResBull,2015,116:67-72.

Alteration of PI3K/Akt/mTOR signaling during development of diabetic cardiomyopathy and regulation of SIRT1

SUN Xiao-hui1,2,3,4, Wang Yan2,3,4, MU Yan-ling2,3,4

(1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250200,China;2.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,China;3.KeyLaboratoryforBiotech-Drugs,MinistryofHealth,Jinan250062,China;4.KeyLaboratoryforRare&UncommonDiseasesofShandongProvince,Jinan250062,China)

Aim To investigate the alteration of Sirt1 and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in type 2 diabetic rats′cardiomyopathy and clarify its role in development of diabetic myocardium.Methods The type 2 diabetes rat model was established by injection of streptozocin after five-week of high fat diet.The rats were randomly divided into model group of 2 weeks, model group of 4 weeks, model group of 8 weeks and control group.The changes of heart function were detected by echocardiography. The alteration of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in myocardium was determined by Western blot.The myocardial cells were randomly divided into following groups:① Control group(normal glucose concentration, 5.5 mmol·L-1);② DMSO group(78.12 mmol·L-1);③ High glucose group(HG,33 mmol·L-1);④ HG+Res(20 μmol·L-1) group;⑤ HG+Nam(40 mmol·L-1) group. The alteration of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in H9C2 cells was determined by Western blot and qRT-PCR.Results WB results showed that Sirt1 was markedly increased in 8 weeks DM rats,compared with 2 weeks DM rats. However,the expressions of PI3K, Akt and mTOR in 2 weeks were significantly increased, without significant change in 4 and 8 weeks. The increased expression of mTOR induced accumulation of S6K1, which was also remarkably increased in 4 weeks after STZ injection, and then it was decreased as DCM developed. WB and qRT-PCR results showed that the expressions of Sirt1, PI3K, Akt, mTOR and S6K1 in HG group were significantly increased compared with control group. Nam treatment significantly lowered Sirt1 expression, resulting in a higher expression of PI3K, Akt, mTOR and S6K1. However,H9C2 cells treated with Res showed a higher expression of Sirt1, resulting in a lower expression of PI3K, Akt, mTOR and S6K1.Conclusion Sirt1 could negatively regulate mTOR signaling in DCM and these changes may be valuable to find a new therapeutic target for diabetic cardiomyopathy.

type 2 diabetes;mTOR signaling pathway;Sirt1;heart function; myocardial injury; resveratol; nicotinamide

時(shí)間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.022.html

2016-12-15，

2017-02-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30701022)；山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥衛(wèi)生科技創(chuàng)新工程；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金計(jì)劃(No BS2013SW008)

孫曉慧(1992-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：1214576499@qq.com； 牟艷玲(1975-)，女，博士，副研究員，研究方向：心腦血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail：myling501@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.011

A

1001-1978(2017)06-0793-06

R-332；R322.11；R341；R394.2；R587.2